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重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 动物细胞培养技术 实验指导教师： 学 院： 专业及类别： 学 号： 姓 名： 实验日期： 成 绩：

罗庆 生物工程学院 生物学（学术） 20161902017t 何英 2016/11/01

重庆大学研究生院制

动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的

1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。

3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。

传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

三、细胞培养相关设施及材料

1、细胞培养室

无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。

制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。

储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。

清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施：

荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。

细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。

3、细胞培养用品的清洗、消毒

新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；

冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。

所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工作台后打开包装。

消毒灭菌：高压蒸汽灭菌（120℃，20min）；紫外线消毒：主要用于实验室房间空气及操作台。

四、实验材料及培养基

1、实验材料：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、酒精灯、吸管、镊子、PBS、0.25%胰酶、DMED高糖和1640培养基、胎牛血清、G2细胞、GLL19细胞、水浴锅。

2、培养基：维持体外细胞培养生存和生长的溶液。 （1）DMED高糖培养基：DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 （2）1640培养基：RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所。 RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。其中含有10%胎牛血清。

五、动物细胞培养的条件

（1）无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。 （2）营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因等） 血清和血浆， 但血清和血浆不是营养物质。 （3）温度和PH：36.5±0.5℃，7.2-7.4。

所需要的特殊条件：

（4）血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生

长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在细胞培养中的主要功能： 1提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物以及主要的低分子营养物等；

2提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调整改变它们所结合的物质活力；

3有些情况下其结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用； 4新生牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料、玻璃等培养基质上所需因子的来源； 5构成缓冲系统，调节酸碱平衡；

6提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害； （5）支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃、塑料等作为支持物。

（6）气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件（95%的空气+5%的CO2混合气体），其中5%CO2气体是为保持培养液的PH稳定。

六、实验内容

1、用倒置荧光显微镜观察细胞形态

Hep.G2细胞来源于15岁白人的肝癌组织，形态为上皮形，多成梭形或多角形，