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组织培养技术在名贵花卉上的应用前景

摘要：综述了组织培养技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了组织培养方法及其在名贵花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了组织培养技术存在的问题及展望。 关键词：组织培养；名贵花卉；应用；病毒检测；前景 1组织培养技术概述

1．1组织培养技术的形成

危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。 1．2组织培养技术研究进展

white于1943年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。Morel等在这个启示下，于1952年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。自1952年以来，通过茎尖分生组织培养或热处理与分生组织培养结合的方法获得成功的实例有100余种，其中最成功的实例之一是马铃薯的脱毒培养Ⅲ。随着植物细胞培养技术的发展，2O世纪5O年代末通过愈伤组织培养脱毒获得成功。7O年代初植物原生质体培养成完整的植株，为利用原生质体培育无毒植株提供了可能性。1975年Shepard_5 通过对瘟染病毒的烟草原生质体的培养得到了无毒植株。1972年Navarro等将果树嫁接方法与茎尖分生组织培养法两者有机结合，创立了一种新的植物组织培养脱毒技术，即茎尖显微嫁接法。这一技术的创立，为果树的无病毒化开辟了一条新的途径。近几年来，应用上述技术在一些很难脱毒的植物上，如菊花、唐菖蒲、矮牵牛、球根鸢尾、风信子、水仙、文心兰、香石竹等都获得了不同程度的成功。 1．3 研究组织培养技术的意义

通过组织培养技术来生产脱毒苗可以实现防治目的，可以消除危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌对植株的危害，使植株原来的一些优良性状重新表现出来，同时由于消除了病毒的影响，植物的生长性能大大增强，能有效提高植物生长指标和经济指标。研究表明，脱毒试管苗比常规苗有更好的生长性能，较高的商品价值和生产利用价值。花卉苗木脱毒后花色鲜艳，品质优良，提高了其观赏价值和商品

性；经济林和用材林苗木脱毒后，能保持其优良性状，生长迅速，增加结果量，提高果实品质和木材利用率；农作物脱毒后表现出生长良好，单位产量和质量提高，市场竞争力增强，达到增产增收的目的，而且如果脱毒苗移栽后管理得当，防治措施做得好，再次感染病毒病的机率比较小，因此植物组培脱毒技术显得非常重要。

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1．4 培养条件

运用于脱毒的组培条件及培养基种类很多。主要生态因子：光照强度一般在1000～2000 lx，日照时8～12小时；温度(24±1)℃；湿度7O ±5 ；pH值5．8±0．1；培养基有MS、White、B5、N6等为主体的添加培养基，较为广泛应用的是MS培养基添加2，4-D，6-BA，NAA等。其中愈伤组织诱导培养基以MS添加6-BA 0.5～2 mg／L，2，4-D 0.5-2 mg／L ,NAA 0.2～0.5 mg／L为宜；分化培养基以MS添加6-BA 0.5～ 3 mg／I ，2，4-D 1～ 2 mg／L，NAA 0.2～0.5 mg／L为宜；生根培养基以1／2MS添加NAA 0.2～0.5 mg／I 为宜。此外，4～5 mg／L PP 有利于芽的分化，0.3 mg／L ABT在生根过程中也较多运用。常见的激素组合是MS+6-BA+NAA或MS+ 6-BA+2，4～D。此外，也有许多单独添加植物激素的情况，但所用浓度略微偏高。作为生长激素主要有IAA、IBA、NAA、2，4-D，细胞分裂素主要有6-BA、BAP、KT、ZT、GA ，一般来说，较高浓度的细胞分裂素促进芽的形成而抑制根的形成，而高浓度的生长素则利于根的形成而抑制芽的形成。 2组织培养方法及其在花卉上的应用 2．1 茎尖培养脱毒

茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分进行的无菌培养。最先开始采用的是Robbins，于1922年切取无菌发芽植物的芽先端长约1 cm部分，接种到琼脂培养基上培养。后来，White对番茄根尖培养也进行了研究。在百合上，利用茎尖培养获取无病毒植株或获得脱毒种球,能有效消除百合潜在病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等病毒病危害，促进生长。香石竹一旦感染病毒病就不能治愈，目前解决此问题的较为行之有效的方法是通过香石竹的茎尖脱毒培养。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养。严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0．1mm，最小的仅有十至几十vm。用这种茎尖分生组织培养，可获得无毒植株。但是，这么小的茎尖实际上很难取得，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，常常采用带有叶原基的生长锥来培养。这种稍大的茎尖容易培养，并且也可能得到无毒的植株，茎尖越大成活率越高，后期生长也越旺盛，而操作技术越简单。如菊花0.6 mm以下的茎尖脱毒效果可达100 ，但成活率仅为37%。 2．2 热处理结合茎尖培养脱毒

为提高脱毒效果，有时将热处理与茎尖培养结合起来，即先把植株放在一定温度的环境下生长一段时问，再取其茎尖进行培养。首先应用热处理与茎尖培养相结合方法是Thomson，于1956年将感染X，Y病毒的马铃薯放在暗处发芽，当芽长到1～2 cm 时用35℃处理7～28 d后，取5 mm的茎尖培养而获得了无毒植株。宋瑞林、韦晓霞等利用此方法脱除了切花菊的番茄不育病毒。近年来的研究证明．用热处理和茎尖培养相结合的方法培育无病毒母本苗效果较好，特别是对于一些难于用茎尖培养或热处理脱毒的果树病毒，此种方法尤为重要。采用这种方法，即使用大的外植体，也能增加无病毒株数 ]。用热处理过的嫩梢进行茎尖培养或将试管苗进行热处理，之后再茎尖培养，可提高脱毒率。在MS培养基上，附加5 mg／L病毒唑培养唐菖蒲，再经38℃～4O℃热处理，切取微茎尖两次，去除了危害唐菖蒲的3种主要病毒TMV、CMV和TVY。百合珠芽经(50±1)℃热水处理40min，培养30 d后，切取0.8～1.0 mm茎尖培养的脱毒效果最好，脱毒率达100%。采用试管芽(37±1)℃热水处理30 d+ 0.2～0.3 mm微茎尖培养处理方法，可以有效脱除水仙病毒。

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2．3 愈伤组织培养脱毒

通过植物器官或组织的培养来诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化出芽长成植株而获得无毒苗的方法。许宏冠、舒秀珍等以感染单一病毒(TAV)的菊花茎尖作为外植体进行组织培养，经愈伤组织分化而得到脱除TAV 病毒的植株。利用这种方法先后在马铃薯、天竺葵、大蒜、草莓等多种植物上获得成功。 2．4 原生质体培养脱毒

Shepard(1975)报道，从感染PVX的烟草叶片的原生质体中可获得无毒苗，他所得到4l4O棵再生植株中有7．5 为无毒苗。病毒丧失的原因可能与愈伤组织培养的情况相同，是由于病毒不能有均等的机会侵染每一个细胞，因此从病叶或茎的健全部分分离得到原生质体，再由原生质体作为原始材料可获得无病毒的植株。Shepard的研究还发现，被PVX与PVY双重侵染的植物叶片分离得到的原生质体培育出的植株，有95% 是无毒的，但对这种现象未能做出解释。 2．5 繁殖组织培养脱毒

目前已有人通过培养花的组织成功地获得了无毒的植株。这一培养方法对柑桔品种尤为有效，因为侵染柑桔的大多数病毒均不能种传。将柑桔类的珠心组织分化成不定胚，最初获得成功的是Rangan等(1958)。1969年Rangan等对单胚性柑桔类进行了研究，并由珠心经培养获得了胚分化的成功，其成功率是所用珠心的l0～20，每一个珠心分化了15～2O个胚。Bitter等(1972)以及Navarro等(1977)正是利用柑桔病毒不能进入珠心和胚珠组织这一特性，从单胚性柑桔类的无病毒化为目标，成功地培育出了健康无毒的柑桔。1974年日本大泽胜次等，首先发现草莓花药培养出的植株可以脱除病毒，并得到了植物病理学家和植物生理学家的证实。此外，还有采用花药培养(NiirT1i一2001)、花芽组培(zh01a一1992)获得无毒百合植株的报道。大丽花花培方法可以使脱毒苗的成功率提高20倍左右，茎尖脱毒只有3～5%。 2．6 茎尖微体嫁接脱毒

在茎尖培养的基础上，Murashige等提出了微体嫁接技术，即将茎尖分生组织嫁接在试管中经脱毒培养的砧木上而得到完整植株n 。微体嫁接解决了某些木本植物利用茎尖培养发根困难、生长缓慢的问题，并可使复合侵染的病毒分离。1983年Navarro等在试管培养l0～ 14 d的梨新梢上，利用长为0.5～1.0 mm带3～4个叶原基的茎尖进行试管微体嫁接，最后获得无毒苗。利用这种方法以后相继在桃、柑桔、苹果等上也获得了无毒苗。此外培养大丽花茎尖培养出来的新茎不生根，把脱毒的茎嫁接到健康的砧木上能得到完整的无毒植株(Morel和Martin(1952))。 3 病毒检测

通过上述脱毒方法获得的组培苗，还不能肯定是否完全脱除了病原物，必须经过检测证明是脱除了这类病原物的无毒苗，才能在生产中推广应用。近十几年来，人们一直在探索比较简便、快速、准确的检测技术，以满足科研、教案和生产的实际需要。最初人们是通过症状表现来判断的，以后采用组织化学染色技术、荧光染色技术、免疫学技术即免疫荧光、免疫电镜、ELISAl_5 及PCR方法。这些技术在不同的时期起到了有效检测作用。利用文心兰的茎尖生长锥诱导出原球茎后，通过症状观察、生物接种、电镜观察和血清学检测方法进行了CMV、TMV、CYMV、ORSV 等4种常见兰花病毒病的检测，成功地建立了3个品种的文心兰脱病毒无性系。 4 前景

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