内容发布更新时间 : 2024/5/27 23:24:07星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

原核蛋白表达常见问题解析

1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？

在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。

2、跨膜蛋白为什么很难表达？

跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：

跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。

3、如何选择蛋白表达宿主菌？

原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。一般选择菌主可看下表: 现象 无蛋白表达 可能原因 改进方案 建议菌株 Rosetta 2 E.coli的密码子偏补充稀有密码子的tRNA；将稀有密码子突变Rosetta-gami 2 出现截短蛋白 移性 为普通大肠杆菌密码子 Rosetta-gami B RosettaBlue Origami 2 降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形二硫键形成困难 成的各种载体标签 包涵体 表达过快，表达量控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化 过高 Rosetta-gami B Origami 2 降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形Rosetta-gami 2 成的各种载体标签 蛋白无活性 蛋白错误折叠 控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化 Rosetta-gami B 细胞死亡，生长毒性蛋白 极困难 pLysS、pLysE菌无克隆生长 过高本底表达 更严格的本底表达控制 株 Rosetta-gami 2 Rosetta-gami B Tuner Rosetta-gami B Tuner 更严格的本地表达控制 pLysS菌株 4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？

答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。

1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。

2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。

（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。

3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。

5、表达得到的蛋白是有活性的么？

答： 需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无， 一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。