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拟南芥花期基因转化烟草及其早花反应特性研究

作者：常爱霞 郭利杰 刘旦 罗成刚 冯全福 魏凯 王兰 来源：《中国烟草科学》2016年第01期

摘要：为探讨花期基因对烟草开花早晚的影响及其在加快育种进程中的利用价值，采用RT-PCR方法从拟南芥克隆获得花期基因（FT），经过测序分析、酶切鉴定后连接到植物表达载体P22上，构建植物重组载体P22-FT。通过农杆菌介导，将FT基因转入烤烟品种Coker 371gold后获得了26株阳性植株。研究结果表明，FT基因对烤烟品种Coker 371 gold的外观形态和花期具有较大的影响；与未转基因对照比较，FT阳性植株平均叶片数少15-16片，平均株高矮80cm，现蕾时间提前了75d左右。通过阳性植株自交分离群体及阳性植株与对照植株的杂交分离群体的鉴定选择，获得了单拷贝FT基因的2个阳性植株。早花基因转化烟草可以有效诱导烟草早花，缩短烟草生育期一半时间，单拷贝可分离早花植株在加快烟草育种进程中具有重要利用价值。

关键词：烟草；FT基因；转基因：花期 中图分类号：S572.03

文章编号：1007-5119（2016）01-0001-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.001

品种是农业发展的基础，如何缩短育种周期，快速培育作物新品种一直是育种家追求的目标。随着早花基因的分离及功能鉴定，研究早花基因在不同作物中诱导早花的反应特性、以及其在育种中的利用价值，对于快速培育作物新品种具有重要意义。

近年来，高等植物成花诱导研究取得了较大进展。植物开花控制基因AGAMOUS、LEAFY、FT等已被成功分离，并且大量研究表明，FT同源基因在拟南芥、水稻、柑橘、番茄、白杨、牵牛花、梨、向日葵和葫芦中的过量表达都能促进开花，有研究预测FT基因具有促进开花的保守功能。在水稻中，FT蛋白于叶片中合成之后转运至顶端分生组织，发挥其诱导开花的功能；在南瓜上也有类似的报道；在拟南芥中，FT基因是控制光周期反应促进早花的关键基因。鉴于FT蛋白在植物开花过程中的主要作用，利用其可以人为的改变植物花期，在植物诱导早花中具有重要利用价值。目前主要有两种应用方法：（l）伤口处理法，将获得的FT蛋白涂抹于植物叶片伤口，可诱导植物早花；（2）利用基因工程方法，将外源FT基因导入植株，使其转录表达，促进开花。第1种方法，每一代都要处理，过程繁杂，并且由于蛋白失活、植物吸收、工作人员处理技术等原因经常失败；相比较来说，第2种是一劳永逸的方法。目前，已经从多种植物中发现并克隆了花期基因，但大都着重于理论研究。FT蛋白能够

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促进早花的特性在植物育种实践中也具有重要利用价值，如利用其可以调节一些花卉植物的开花时期，在开花期较长的树木育种工作中加快育种进程，在作物育种中可以加快目标性状的快速定向转移等，但相关研究尚处于探索阶段。烟草作为重要的基因工程模式作物，国外近年来已经开始开展FT基因转化烟草以加快育种进程的研究，国内也有利用FT基因PVX病毒瞬时表达载体，涂抹烟草使FT基因瞬时表达诱导烟草早花的报道，但有关FT基因转化烟草的早花反应特性及其在育种中如何利用，国内尚未见相关报道。

本研究拟采用RT-PCR技术，从拟南芥中分离获得FT基因，构建植物表达载体，进而通过农杆菌介导法转入烤烟品种Coker37lgold，以期观察了解FT基因对Coker37lgold花期的影响，同时鉴定获得转单拷贝FT基因的烟草植株，为利用早花基因加快烟草育种进程奠定方法及种质材料基础。 1 材料与方法 1.1 来源

拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烤烟品种Coker37lgold.根癌农杆菌EHA105、克隆载体JET由中国农业科学院烟草研究所保存；植物表达载体P22由深圳华大基因研究院（华大）合成提供。创建的转基因阳性植株以及试验过程中所有种质材料均在中国农业科学院烟草研究所青岛温室进行隔离种植。 1.2 方法

1.2.1 花期基因FT的克隆根据GenBank上的FT （GeneID：842859）序列设计两端引物，并在引物5’端引入Sac I酶切位点，3’端引入Spe I酶切位点，以拟南芥的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，电泳获得的目的片段，经过切胶回收、连接克隆载体、转化大肠杆菌之后，送菌样至上海生工生物工程有限公司测序。前后引物序列是：FTF：AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC；

FTRCACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT。其中，下划线两碱基间为酶切位点。 1.2.2 表达载体的构建P22载体由华大合成，如图l。表达载体P22以及凝胶回收的PCR产物分别用限制性内切酶Sac I和Spe I处理，回收纯化，用T4 DNA连接酶置于4℃连接，转化大肠杆菌感受态细胞。涂布于含有潮霉素的LB培养基，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落于10mL LB液体培养基，37℃、200r/min振荡lOh，小量提取质粒。用限制性内切酶Sac I和Spe I切割重组质粒，电泳鉴定重组子。经上海生工生物工程有限公司测序，获得重组表达载体P22-FT。

1.2.3 P22-FT转化农杆菌感受态细胞培养将构建好的2.5μL P22-FT质粒载体加入100μL农杆菌感受态细胞中，冰浴10min。冰浴后，液氮冷冻5min，然后在37℃水温浴5min后，28℃慢速振荡培养3h，最后接种于YEB固体培养基28μ℃培养约48h。以农杆菌菌液为模板进行

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PCR扩增，鉴定阳性克隆。获得阳性克隆后挑取单菌落，接种于含潮霉素50mg/L的20mL YEB液体培养基，在27℃、180r/min摇动培养后用于叶片侵染。

1.2.4 农杆菌介导烟草转化及其再生苗的获得采用叶盘法转化烟草，经侵染、共培养之后，将长至lcm以上的不定芽切下并转移到潮霉素生根培养基（MS+NAA0.1mg/L+潮霉素50mg/L）上，诱导生根，获得转基因烟草苗，然后移栽。

1.2.5 转基因烟草的DNA提取及PCR检测对获得的转基因植株，提取叶片DNA，采用潮霉素抗性基因检测引物HYG，进行PCR扩增（94℃变性lmin，55℃复性lmin，72℃延伸lmin，30个循环），预期扩增产物大小是521bp，如转基因植株扩增产物含有该条带，则认为是阳性植株。引物序列是：HYGF：CGATTCCGGAAGTGCTTGAC：HYGR： CGTCTGCTGCTCCATACAAG。

1.2.6 转基因植株的表型观察将对照植株和转基因阳性植株同时置于相同条件的温室中培养，通过观察和分析两类植株的花期表型以及株型变化，确认外源FT基因对是否对烟草花期起调控作用。

1.2.7 转单拷贝FT基因烟草的植株鉴定筛选分别建立转基因植株自交群体以及转基因植株和非转基因植株杂交群体，统计不同遗传群体中早花植株数量和非早花植株数量，用SPSS 19.0软件作卡方检验，验证自交群体早花植株与非早花植株比例是否符合3：1，杂交群体是否为1：1，据此统计结果筛选转单拷贝FT基因植株。 2 结果

2.1 FT基因的克隆及转化

从拟南芥中提取RNA，利用合成的FT基因引物进行RT-PCR，获得扩增产物约为600bp（图2），符合预期片段大小，切胶回收并测序，做序列比对分析，结果表明克隆产物为FT基因的完全编码序列，与GenBank上登录的FT基因同源性达100%。

进一步构建含有FT基因的P22表达载体，经过Sac I和Spe I双酶切电泳，从重组的质粒中获得了约600 bp的片段（图3），与目的基因大小相符合，说明外源FT基因已经插入到质粒中，P22-FT表达载体构建成功。

构建成功的植物表达载体P22-FT用冻融热击法转化农杆菌感受态细胞之后，28℃倒置培养2-3d，随机挑取平板上的单菌落，于YEB液体培养基中摇菌培养，并用菌液做模板进行PCR扩增，结果显示在所挑选的菌斑中有4个显示有预期大小的PCR扩增产物（图4），说明植物表达载体转入农杆菌中。