内容发布更新时间 : 2024/5/5 6:52:19星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

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实验原理

蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。

电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。

蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶

水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL

5%浓缩胶

水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL

1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液

Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液

Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液

Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST

Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1mL，加去离子水至1L Stripping

1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤

1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑴凝胶配置

①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。（使蛋白样品分离）

②浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品

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槽梳子。室温下浓缩胶聚合，约20~30min。（使蛋白样品浓缩） ⑵蛋白样品的处理

将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.5~1mg/ml。然后转移到小离心管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸出），在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。暂时用不到的话，可放在﹣20℃冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min，以除去亚稳聚合态物质。上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。 ⑶加样

拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上，若样品槽中有气泡，用枪头挑除。按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋白和未知蛋白样品，每孔的加样量要相同，一般加样体积为10~30μl，加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近底部，记录加样顺序。 ⑷电泳

上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为120V，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1cm时停止电泳。 2 蛋白质的电转移 ⑴水平半干式电转移

①戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDS—PAGE胶各大1cm。 ②裁剪与SDS—PAGE胶长宽相等的NC膜。

③将3张滤纸和SDS—PAGE胶浸在负极转移液中待用。 ④将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。

⑤将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在负极滤纸上依次铺放SDS—PAGE胶、NC膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。注意排除气泡，因为 气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑”。

⑥盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。 ⑵垂直湿式转移

①凝胶片的平衡：把电泳后的凝胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡30~60min,以除去胶中的SDS，使其pH及离子强度和印迹缓冲液相一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。

②将转移缓冲液冷却至4℃

③准备NC膜和滤纸：戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转移缓冲液浸润膜和滤纸15min，直到没有气泡， ④将海绵在转移缓冲液中充分浸湿

⑤打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿的海绵，然后合上转移夹。

⑥转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极NC膜靠近正极 将转移槽放到4℃冰箱内，电转移，恒流80mA，4 h。 3 免疫印迹分析

⑴NC膜上总蛋白的染色和脱色：将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标出标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白质相对分子质量所需。然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。 ⑵特异性抗体检测

①脱色后的NC膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温下封闭2h以上。（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）

②倒出封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5min。（除去封闭液）

③漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4℃摇床过夜或室温放摇3h（一抗

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与目的抗原蛋白特异性结合）

④利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未结合的一抗） ⑤将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min

⑥倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL的A液和B液以1:1体积混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/㎝2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内曝光数秒。

在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中。在红灯下取出 X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）。打开 X-光片夹，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时。根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，曝光完成后，打开X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间。显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止。用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 注意事项

①在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 ②不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白

③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键。对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDS—PAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。

④尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子。

⑤蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰 ⑥尽量使用新鲜的loading buffer，样品要与loading buffer混合均匀， ⑦不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性， ⑧Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动。

⑨电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，

⑩硝酸纤维素（NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小。 非特异性本底显色浅。价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失。 NC韧性较差，易损坏。

聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。但价格上稍贵。

为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小要先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用于PVDF膜）。传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。高背景可能的原因：膜未均匀浸泡。膜或缓冲液污染。封闭不充分。抗体与封闭液出现交叉反应。抗体浓度过高。解决方法有：转膜前用100%甲醇将膜完全浸泡。杂交前检测一抗、二抗。检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 作用

定性分析蛋白质，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量，分析目的蛋白表达的特异性。 蛋白样品的制备

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