内容发布更新时间 : 2024/5/12 11:03:02星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

琼脂糖凝胶电泳

1）试剂配制：

a. 0.5mmol EDTA: 电子秤称取EDTA 93.05g后加入400mL去离子水，调PH至8.0，用去离子水定容至500mL。 b. 50×TAE缓冲液储存液：

Tris 242g 冰乙酸 57.1mL EDTA (0.5mmol/L, PH=8) 100mL

使用时将上述储存液稀释50倍至1×TAE缓冲液，即量筒量取50×TAE 20mL，用去离子水定容至1000mL，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。 2）制胶

a. 根椐凝胶浓度（如下表）以及制胶量（两块），在电子秤上称取1g琼脂糖粉三角锥瓶中，量取50mL 1×TAE缓冲液也倒入三角锥瓶中。

表2-3 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖浓度（%） 0.50 0.7 1 1.20 1.50 2 2～5

最佳线形DNA分辨范围（bp） 1 000～30 000 800～12 000 500～10 000 400～7 000 200～3 000 50～2 000

20～1 000

b. 在三角锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解加热琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复3次左右，直至琼脂糖完全溶解。

c. 使溶液冷却至60℃左右，加入按照1 uL / 10mL的比例加入DNA 染料gelstain，并充分混匀。

d. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。一般倒入25mL左右琼脂糖溶液，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。

e. 在室温下使胶凝固，大约30分钟左右（确保接触的地面平整）。 3）上样

a. 取5ul样品与2ul 6×上样缓冲液loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。 6×Loading buffer: 30mM EDTA 36%(v/v) Glycerol

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF 0.05%(w/v) Bromophenol Blue 主要用于DNA电泳 10×Loading buffer: 30mM EDTA 50%(v/v) Glycerol

0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF 0.25%(w/v) Bromophenol Blue 主要用于RNA电泳

混匀后，用微量移液枪小心加入样品槽中，在样品前面或者后面加入10ul DNA Marker。

b. 注意每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 4）电泳

a. 加完样后，盖上电泳槽盖，接通电源。控制电压在100 V，电流在400 mA，时间为30min（注意根据之前电泳的DNA片段大小来确定的）。 b. 当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约30 min），停止电泳。 5）紫外下拍照并保存