内容发布更新时间 : 2024/5/18 15:34:59星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

DAPI

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

DAPI介绍

在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在500nm左右。

DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。

DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。

中文名：4，6-联脒-2-苯基吲哚(?)

英文名：4',6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI dihydrochloride

分子式：C16H15N5 分子量：277.324 CAS number：28718-90-3

光谱性质： DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm

与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm；与RNA结合时，最大发射移动到400 nm左右。

DAPI染色原理：

DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到细胞核的形态变化。

a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。 b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。 c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。 d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。

染色步骤：

在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。

存储条件：-20℃避光保存

每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装 注意事项：

1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。

2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 μg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。

3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

Hoechest 染色

三种染料都可在350nm左右的紫外光激发。都在461nm处发出蓝靛色荧光。未被结合的染料最大发射光在510到540nm之间。可被氙-氩灯或水银-氩灯或紫外激光激发。激发光和发射光之间的斯托克斯位移巨大，故可用于多染料多颜色荧光染色。Hoechst染料的荧光强度随着溶液pH升高而增强。

Hoechst染料溶于水和有机溶剂，如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。浓度可高达10mg/mL.水溶液可在4 °C避光保存至少6个月。长期储存于≤-20 °C

Hoechst与DNA双链中的小沟（minor groove）结合，更倾向与于富含A/T（腺嘌呤/胸腺嘧啶）的DNA链。虽然说它能与所有的核酸结合，但是富含AT的双链DNA使荧光强度显著增强。

Hoechst可穿过细胞膜，可结合于活细胞或固定过的细胞。因此可用于活细胞标记。

Hoechst是一种膜通透性的荧光染料，故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。

常用Hoechst33258和Hoechst33342，前者渗透性不如后者好，多用于活细胞染色，而后者活细胞和死细胞均可。Hoechst33342 能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA ,使之发出明亮的蓝色荧光。凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异,很易判别。

Hoechst 染色方法：

1. 贴壁细胞

A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。 B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 D. 加入终浓度为10μg/ml的 Hoechst染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍。

F. 将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。切勿弄反。 G. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

2. 悬浮细胞

A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E. 均匀滴加Hoechst染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍。

G. 盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 H. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。