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专题3 植物的组织培养技术

在《生物技术实践》模块课程标准中，植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”。尝试是技能性目标中的模仿水平，即学生仿照教师的示范性动作完成对实验对象的操作。

植物组织培养是一项操作复杂而精细，操作难度较大的实践活动，其操作流程包括：配制母液、培养基配制与灭菌、外植体选择和消毒、接种、形成愈伤组织、诱导丛芽和生根、组培苗移栽等操作环节。从操作的持续时间看，完成前四项活动需要一天，后三项活动需要1～2个月。为了确保在有限的时间内顺利地开展实验教学，需要确定学生动手操作的一些重要环节和步骤，并针对这些环节和步骤提前做好实验准备。

1 实验室的准备工作

本实验需要作好三项实验准备：一是提前配制各种母液；二是提前准备MS培养基；三是选择外植体并进行预处理。

1.1 配制母液

母液中含有大量元素、微量元素、激素（植物生物调节剂）和维生素等有机成分，母液浓度是实际溶液浓度的5～10倍。配制母液花费时间多，需要用到溶量瓶、移液管等精密仪器，无法由每位学生亲自操作，教师可带领部分学生在课外进行。母液的类型和配制顺序如下：

配制母液的注意事项：⑴自来水或河水中含有大量的矿质元素，勿用配制母液；⑵配制大量元素和微量元素母液时，应将每种化合物单独溶解后，再一一混合，同时还应用适量的蒸馏水清洗烧杯内壁，并将清洗后的蒸馏水倒入混合溶液中，这样可以保证每种元素的浓度，混合时要按照教材附表中的顺序进行，最后加入的是氯化钙溶液，这样可以避免发生沉淀；⑶配制好的母液要先倒入1 000 ml烧杯中，再由烧杯转入1 000 ml细口瓶中，不可由容量瓶直接倒入细口瓶中；⑷注意观察母液中是否有絮状物，出现絮状物表明离子之间发生反应，需要重新配制母液；⑸植物生长调节剂难溶于水，需要碱或酸助溶，一般生长素类物质用碱（0.1 mol/LNaOH1～3 ml）或酒精（75～95％的酒精1～3ml）助溶，细胞分裂素类物质一般用酸（0.1 mol/LHCL1～3 ml）助溶，加入蒸馏水定溶时要缓慢，也可用水浴法助溶；⑹用棕色细口瓶盛装有机物母液和植物生长调节剂母液，避免透射光损害母液中的有机成分；⑺在瓶壁上贴好各种母液的标签（下图所示）；⑻将配制好的母液放入冰箱中或阴凉处保存。

MS是穆拉希吉（Murashige）和斯库克（Skoog）两位科学家第一个字母的缩写，他们于1962年为培养烟草而设计了一种培养基，这就是组培使用中最为广泛的MS培养基；标签中间一行的数字及单位表示的意义如下，例如，100ml/L，即配制1升培养基只需从母液中提取100ml

即可；50mg/100ml，表明100ml母液中含有50mg萘乙酸，如取4mg的萘乙酸，只需提取8ml母液。

除母液需提前配制好外，消毒液也需要提前配制好。外植体消毒一般采用75％的酒精、2～10％的次氯酸钠溶液等。

1.2 培养基的配制与灭菌

培养基的类型有很多种，通常采用MS培养基。配制培养基的流程如下：

上述的培养基配制流程中，加入各种母液的时间是在琼脂溶化之后，这样既可避免加热使母液中的各种离子发生反应，又可避免有机物母液和植物生长调节剂因高温受到损害。将母液加入培养基的顺序是：先提取大量元素、微量元素、铁盐、有机物母液，后提取植物生长调节剂母液，切勿先提取植物生长调节剂母液，这是因为该溶液中含有酸或碱，容易与其他元素形成沉淀而失败。

培养基通常采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间一般为15～20min，灭好菌的培养基不易保存过长时间，通常是现用现配。在对培养基灭菌的同时，也要对解剖刀、镊子、烧杯、锥形瓶、牛皮纸等必要的仪器设备进行灭菌。

1.3 外植体的选择和预处理

根据植物细胞的全能性原理，选择任何活的植物体都能培养出组培苗，但不同植物的各种组织和器官的分裂能力不同，同时还要考虑消毒处理的特殊情况，因此，选择恰当的外植体进行接种既有利于消毒，避免污染，又有利于在较短时间内形成组培苗，从而提高组培成功率。下面是选择外植体时需要考虑的一些因素及说明。

考虑的因素 外植体的年龄 说 明 一般情况外植体的年龄越小，分化的程度越小，组培的成功率就越高，因此，尽量选择幼嫩的植物组织或器官作为外植体 外植体很小和很大都不合适，很小的外植体极容易死亡，很大的外外植体的大小 植体不容易消毒，因此，要选择大小适中的外植体。例如，如果用菊花的芽进行组培，选取的芽可为3mm左右 外植体所在的部位 外植体的外观形态

一般选择植物的芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体，这些部位的组织分裂能力强，容易形成愈伤组织 由于外植体的消毒工作非常重要，因此，要选择哪些表面相对光滑容易消毒的外植体较好

选择好外植体后教师还要做一些预处理，以便学生进一步消毒时能有效地杀死外植体表面的微生物。预处理包括：用清水冲洗；用洗涤灵或洗衣粉清洗；芽作为外植体时要放在锥形瓶中加清水反复振荡，如果芽中有很多凹陷，还需要用毛刷轻刷；用自来水细流冲洗2～4小时左右。组培室要进行紫外线消毒，或用化学药剂如甲醛和高锰酸钾进行蒸汽消毒。操作台、接种器械、工作服等都要提前进行消毒，等等。

2 教学建议

2.1 重视实验原理的学习，帮助学生形成网络化的知识结构

组培的原理及过程是教学中的重点，对于学生理解组培在生产实践中的重要性具有十分积极的现实意义，同时，有助于学生理解生命的本质，以及人类对生命现象进行干预的意义。组培的原理、过程及作用可用下面的图示表示。

为帮助学生理解组培的原理、操作和过程，教学时可引导学生讨论下列问题：⑴灭菌和消毒的区别以及在组培中是如何应用的？⑵在脱分化和再分化过程中怎样使用植物生长调节剂? ⑶组培过程中有时需要换瓶操作，这是为什么（改变培养基中的植物生长调节剂的浓度比例）? ⑷组培过程中的每一步都需要光照吗（愈伤组织的形成不一定需要光照，但丛芽和根的形成需要光照）?⑸组培中用的蔗糖作为能源和原料物质，用葡萄糖行不行（使用蔗糖主要是考虑经济因素，也可用葡萄糖或果糖替代）？⑹花药离体培养获得的植物幼苗都是单倍体吗（不是，也有正常的植物体）？等等。

2.2 合理安排时间，确保学生动手操作关键的步骤

既然我们不可能让每一位学生都经历组培的全过程，但又要让学生实践操作，因此，选择什么样的操作环节让学生实践就显得尤为重要。以下的几种方案供参考和借鉴。

方案1：学生完成外植物体的消毒和接种工作。外植体的消毒工作至关重要，需要那些操作认真、细致的学生才能够很好地完成，因此这种方案要求学生具备一定的操作技能，并且做到耐心、细致。外植体的消毒流程如下。