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Ｎ-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸胆甾醇酯共聚物研究

曾宏波 李耀邦 张昊宇 王晓工

(清华大学材料科学与工程研究院化工系高分子研究所 北京 100084)

两亲性聚合物在同一分子链中包含亲水和亲脂结构单元,具有独特的水溶液行为,在很多领域得到了广泛应用.两亲性聚合物通过水溶液的选择性溶解效应,一定条件下可以聚集成具有较窄粒径分布的聚合物胶束.胶束的典型特征是其核 壳结构,亲脂单元由于疏水作用在水溶液中自组装成胶束的内核,亲水链段则包围在内核的周围形成一个较为舒展的壳层[1].由于两亲性聚合物胶束内核有较高的药物包埋能力,胶束在体内选择性分布的特点,近年来其在靶向药物传递和药物缓释领域的应用备受关注[1].携带药物的聚合物胶束在体内分布主要是由其胶束尺寸和表面(壳层)性质决定的,而受到包埋在胶束内核的药物性质的影响较少.因此,胶束壳层性质和胶束尺寸设计是聚合物胶束药物传递体系实现有效控制的关键因素.溶液中聚合物胶束内核形成的直接动力是包括疏水聚集作用,金属络合、电荷作用,及氢键作用等相互作用也会有一定的影响[2].一般而言,疏水性内核应具有生物降解性.一些非生物降解性的聚合物(如聚甲基丙烯酸甲酯[3]、聚苯乙烯[4,5])目前也用于此领域的应用研究,但这些聚合物必须无毒,其分子量较低,能够被体内正常代谢排出.聚合物胶束的壳层一般不要求生物降解性,但要具有生物相容性,如聚氧化乙烯等.近年来,具有热敏性或者ｐＨ敏感性的聚合物如聚(Ｎ 异丙基丙烯酰胺)(ＰＮＩＰＡＭ)[6～8]和聚丙烯酸[9]等也被用来制备刺激响应性的壳层结构.ＰＮＩＰＡＭ在其大分子链上同时具有亲水的酰胺基团和疏水的异丙基,使得ＰＮＩＰＡＭ呈现出温度敏感性.在常温下,ＰＮＩＰＡＭ溶于水中形成均匀的溶液,当温度升高至32℃左右时,溶液发生相分离.相变点的温度定义为最低临界溶液温度(ＬＣＳＴ).ＰＮＩＰＡＭ在ＬＣＳＴ附近的相转变是一种温度敏感的可逆变化,所以可以利用此温度敏感效应来控制包埋在胶束内部的药物释放.胆甾醇是一种具有生物相容性但很疏水的化合物,胆甾醇类化合物在血液中主要是以载脂蛋白(Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ)的形式存在,血液中的载脂蛋白可以简单地看成由胆甾醇、胆甾醇羧酸酯、甘油三酯以及蛋白质等多种有机分子的“共聚集体”,胆甾醇和胆甾醇羧酸酯在各种载脂蛋白中的迁移、运动等行为和疏水亲脂作用密切相关[10].因此胆甾醇酯类是一种理想的聚合物胶束药物载体核层材料.

关于丙烯酸胆甾醇酯疏水化修饰聚异丙基丙烯酰胺已有文献提及[11],但只报道了在一种投料比下合成的Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＣＨＡ)共聚物,未对聚合物结构(如共聚物组成比等)、聚合物性能和溶液行为等进行系统表征和深入研究.本文以Ｎ 异丙基丙烯酰胺(ＮＩＰＡＭ)为温敏结构单元,丙烯酸胆甾醇酯(ＣＨＡ)为疏水结构单元,合成了一系列不同ＰＮＩＰＡＭ ＣＨＡ摩尔组成比的无规两亲性共聚物.利用浊度法、荧光探针法、表面张力法等对上述两亲性共聚物的最低临界溶解温度(ＬＣＳＴ)和胶束形成能力等进行了系统的研究,并探索这类温度敏感性聚合物胶束在药物控制释放中应用的可能性. 1 实验部分

1.1 主要原料及仪器表征

胆甾醇,天津市化学试剂公司,生物试剂.Ｎ 异丙基丙烯酰胺,自制.1,4 二氧六环,北京化工厂,分析纯,减压蒸馏提纯.四氢呋喃,北京化工厂,分析纯.偶氮二异丁腈(ＡＩＢＮ),无水乙醇重结晶提纯.石油醚,北京化工厂,分析纯.红外光谱分析采用Ｎｉｃｏｌｅｔ560 ＩＲ傅立叶红外光谱仪;浊度分析采用ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬａｍｂｄａＢｉｏ 40紫外可见光谱仪;1Ｈ ＮＭＲ测定采用ＢｒｕｋｅｒＡＭ500核磁共振仪;胶束和分布测定采用激光粒度分析仪Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ3000ＨＳ(ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ,ＵＫ);溶液表面张力测定采用ＯＣＡ20视频光学接触角测量仪(ＤａｔａｐｈｙｓｉｃｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ,Ｇｅｒｍａｎｙ).荧光探针分析采用Ｆ 4500荧光光谱仪(ＨｉｔａｃｈｉＨｇｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ,Ｔｏｋｙｏ,Ｊａｐａｎ);共聚物的分子量的测定是采用Ｗａｔｅｒｓ150Ｃ型凝胶渗透色谱仪,以窄分布的聚苯乙烯试样为标准,四氢呋喃为淋洗液. 1.2 单体和聚合物的合成 1.2.1 丙烯酸胆甾醇酯

将12.12ｇ(0 0314ｍｏｌ)胆甾醇和8ｍＬ丙烯酰氯(过量)溶解在50ｍＬ无水苯中,加入少量对苯二酚作阻聚剂,加热回流反应7ｈ.将反应液溶于70ｍＬ乙醚,依次用饱和Ｎａ2ＣＯ3溶液,10%ＨＣｌ溶液,饱和ＮａＣｌ溶液洗涤;分液收集有机相,无水ＭｇＳＯ4干燥过夜.旋转蒸发大部分溶剂,将浓缩后的溶液再溶于一定量的无水乙醚中,加入大量无水乙醇沉淀,得白色粉末状固体,收率为78.2%.产物经过红外光谱和核磁共振测定,证实其结构符合丙烯酸胆甾醇酯[12]. 1.2.2 ＮＩＰＡＭ ＣＨＡ共聚物

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将ＮＩＰＡＭ(10ｍｍｏｌ),不同量的丙烯酸胆甾醇酯(0.1ｍｍｏｌ,0.125ｍｍｏｌ,0.5ｍｍｏｌ,3.33ｍｍｏｌ,6 67ｍｍｏｌ)和适量引发剂ＡＩＢＮ(为反应单体总物质的量的0.13%),溶于20ｍＬ新蒸的1,4 二氧六环中,氮气保护下搅拌,水浴60℃反应24ｈ,冷却,将反应混合物在搅拌条件下滴入大量石油醚中沉淀,有白色粉末状固体出现.将此沉淀干燥后再溶于20ｍＬ四氢呋喃中,再用石油醚沉淀,反复此过程两次,最后得到较纯的白色粉末状聚合物. 1.3 ＮＩＰＡＭ ＣＨＡ共聚物的ＬＣＳＴ测定

ＮＩＰＡＭ ＣＨＡ共聚物的ＬＣＳＴ的确定采用浊度法和荧光探针法.浊度法为配制0.25%共聚合物水溶液,聚合物水溶液在每一指定温度下恒温30ｍｉｎ后,测定其在550ｎｍ处的透光率.将透光率对温度的变化作图,曲线的拐点定义为该聚合物的ＬＣＳＴ[13].荧光探针法选用芘(Ｐｙ)为的探针分子,在溶液中芘的浓度小于10-5ｍｏｌ Ｌ时,可观察到具有精细结构单体激发态荧光,依次在373ｎｍ、379ｎｍ、384ｎｍ、390ｎｍ、397ｎｍ附近出现五重发射峰.利用第一发射峰与第三发射峰强度比(Ｉ1 Ｉ3)作为芘“极性标尺”[14],检测其周围环境极性的变化.在实验中,将一定量芘的四氢呋喃溶液和不同量聚合物的四氢呋喃溶液混合,然后加入大量二次蒸馏水,使芘的最终浓度为5×10 7ｍｏｌ Ｌ,超声振荡进一步分散溶液后,暗处静置24ｈ后,测定其荧光光谱后计算Ｉ1 Ｉ3值. 1.4 表面张力的测定

配置不同浓度的共聚物水溶液,采用滴重法来测量其水溶液的表面张力.溶液滴速为1μＬ ｓ,当悬挂液滴达到最大时,仪器自动记录液滴的体积,根据公式(1)计算出溶液的表面张力. γ=φＶρｇ 2πｒ(1)

式中Ｖ为液滴体积,ρ为聚合物溶液密度,当浓度很小可以近似为相同温度下水的密度,ｒ为滴管的外半径.φ为校正因子,仪器自带.

1.5 共聚物胶束对胆甾醇的包埋

配制共聚物Ｐ(Ｎ Ａ)(20∶1,ｍｏｌ∶ｍｏｌ)的四氢呋喃溶液(2ｍｇ ｍＬ)和胆甾醇的四氢呋喃溶液(36.2ｍｇ ｍＬ).用微量计量器量取300μＬ聚合物的四氢呋喃溶液分别与10μＬ和20μＬ胆甾醇的四氢呋喃溶液混合,用二次蒸馏水稀释到10ｍＬ(分别记为样品1、样品2),然后超声振荡进一步分散胶束溶液.样品1和2在25℃稳定24ｈ后,利用激光粒度分析仪(Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ3000ＨＳ)测量两个样品中胶束的平均粒径和分布. 2 结果与讨论

2.1 Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＣＨＡ)合成和表征

共聚物的合成路线如图1所示.在所合成的不同共聚比ＮＩＰＡＭ ＣＨＡ的共聚物的ＩＲ和1Ｈ ＮＭＲ谱图中,均可以看到这两种结构单元对应的特征吸收峰.图2为ＮＩＰＡＭ和ＣＨＡ以投料比为1 5∶1和20∶1共聚所得共聚物(分别简称为共聚物Ｐ(Ｎ Ａ)1 5 1(ａ)和Ｐ(Ｎ Ａ)20 1(ｂ))的红外谱图(ＫＢｒ,ｃｍ-1).1731ｃｍ-1,1652ｃｍ-1分别为共聚物中ＣＨＡ结构单元中羧酸酯羰基和ＮＩＰＡＭ单元的酰胺羰基的特征吸收峰.可以看到,随着共聚物中ＮＩＰＡＭ含量的增加,羧酸酯羰基在1731ｃｍ-1附近的吸收峰逐渐变小.用ＧＰＣ法测定的聚合物分子量和分布的数据见表1.

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共聚物的组成比是通过核磁共振分析确定的,即通过测定不同单体具有的特征核磁共振吸收峰面积比而确定的.图3所示为ＮＩＰＡＭ和ＣＨＡ以投料比为100∶1共聚所得共聚物(Ｐ(Ｎ Ａ)100 1)在ＣＤＣｌ3溶液中的1Ｈ ＮＭＲ谱图.其中化学位移δ=0 7处的峰为丙烯酸胆甾醇酯残基中直接与五元环相连的—ＣＨ3上质子的核磁共振吸收[15],而化学位移δ=4 0处的峰则为Ｎ 异丙基丙烯酰胺上异丙基叔碳质子的核磁共振吸收.通过计算这两种氢吸收峰面积之比,就可得到共聚物的组成比.其它各个共聚物的组成比计算与此类似,得到的结果如表1所示.

2.2 Ｐ(ＮＩＰＡＭ ｃｏ ＣＨＡ)的温敏性

ＰＮＩＰＡＭ分子内同时具有亲水性的酰胺基和疏水性的异丙基,它们与水分子之间存在不同的相互作用.在ＬＣＳＴ以下时,ＰＮＩＰＡＭ大分子链周围的溶剂水分子由于氢键和范德华力作用形成一种由氢键连接的、有序化程度较高的溶剂化壳层.随着温度的升高,ＰＮＩＰＡＭ与水的相互作用参数发生突变,使其分子内部和大分子间的疏水相互作用加强,形成疏水层,部分氢键被破坏,最终大分子链疏水部分的溶剂化层被破坏,水分子从溶剂化层排出,体系发生相变,即表现出温敏性.

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