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塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导大鼠尿道下裂的实验研究

李明勇，陈柏林，邱 林，华 燚，何 昀 温 晟 龙春兰 魏光辉 [400014重庆，重庆医科大学附

属儿童医院：泌尿外科，烧伤整形外科，儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆市（儿童发育重大疾病诊治与预防）国际科技合作基地]

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[摘要] 目的 采用塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（DEHP）宫内暴露诱导建立大鼠尿道下裂模型，观察DEHP的外生殖器毒性作用。方法 孕鼠40只，完全随机分成4组：大豆油对照组和DEHP低中高3个剂量组（分别为500,750,1000mg/kg bw/d）。在怀孕天数（GD）第12～19天连续灌胃，出生后（PND）第1天即对新生鼠进行计数，称量体重和测量肛门生殖器距离（AGD）；PND30测量阴茎长度，观察每组雄性仔鼠的尿道开口位置，判断有无尿道下裂及其严重程度并切取整个阴茎进行病理组织苏木精-伊红（HE）染色。结果 与对照组相比，随着DEHP暴露剂量增大，每窝产活仔数及雄性活仔数均较对照组有显著减少；同时仔鼠的体重减轻、AGD和阴茎长度缩短明显（P<0.05）。DEHP低中高剂量组诱导出雄性仔鼠尿道下裂畸形发生率分别为10.7%，30.6%和37.0%，重型尿道下裂发生率分别为0，8.3%和22.2%，各剂量组间差异显著（P<0.05）；阴茎组织横截面石蜡切片HE染色予以验证。结论 DEHP大鼠宫内暴露成功建立尿道下裂模型，且对子代具有一定的发育和外生殖器毒性效应。

[关键词] 尿道下裂；邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯；塑化剂；SD大鼠；动物模型 [中图法分类号] R726.9；R124.3 [文献标志码] A

Study on hypospadiac male rats induced by maternal exposure to di-(2-Ethylhexyl) phthalate plasticizer

Li Mingyong, Chen Bolin, Qiu Lin, Hua Yi, He Yun, Wen Sheng, Long Chunlan, Wei Guanghui（Department of Pediatric Urology Surgery, Department of Pediatric Burns and Plastic Surgery; Chongqing Medical University affiliated Children's Hospital, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, CSTC2009CA5002, Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders, Chongqing 400014, China.）

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[Abstract] Objective The aim of this study was to establish a hypospadiac rat model by maternal exposure to di-(2-Ethylhexyl) phthalate (DEHP) plasticizer and to evaluate the external genitalia developmental toxicity of male rats. Methods Forty timed-pregnant rats were given DEHP by gastric intubation at doses of 0, 500,750 or 1000 mg/kg body weight (bw)/day from gestation day (GD) 12 to 19 to establish a hypospadiac rat model. On postnatal day (PND) 1, live pups were counted, male pups were weighed and their anogenital distance were measured. On PND 30, the penial length were measured and hypospadias was observed in each group; transverse serial histological analysis of

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male genitalia of hypospadiac male rats confirmed the malformation. Results Compared with control group, with exposed dose increasing, the live pups and live male pups per litter counted less and less, significantly decreased body weight, radio of anogenital distance and length of penis were observed (P<0.05). The hypospadias incidence of three dose DEHP groups was 10.7, 30.6 and 37.0%, respectively, that incidence of severe hypospadias was 0, 8.3, and 22.2%, respectively, and there are significantly statistical difference among each groups (P<0.05). Conclusion A typical hypospadiac rat model was established by maternal exposure to DEHP plasticizer, and the results indicated that reproductive system and developmental condition of hypospadiac male offspring were damaged by DEHP.

[Key words] hypospadias; di-(2-Ethylhexyl) phthalate; plasticizer; sprague-dawley rat; animal model.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81102093) and the Natural Science Foundation of Chongqing（CSTC2009BB5414）. Corresponding author: Wei Guanghui, Tel. : 86-23-63631928, E-mail: ghwei@cqmu.edu.cn.

[基金项目] 国家自然科学基金青年基金（81102093）；重庆市自然科学基金（CSTC 2009BB5414） [通信作者] 魏光辉，电话：（023）63631928, E-mail: ghwei@cqmu.edu.cn

尿道下裂（hypospadias）是小儿泌尿生殖系统最常见的畸形之一，主要表现为尿道异常开口于阴茎腹侧、阴囊、或会阴，部分病例还伴有阴茎发育不良、阴茎屈曲畸形、包皮发育异常[1]，约占新生儿1/250，根据最新国内外流行病学统计，其发生率逐年上升且在近30年翻了一番[2]；但其病因仍然不明。研究认为环境中天然和人工合成的环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors，EEDs）暴露可能是尿道下裂发生和不断增多的主要原因[3]。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（Di-(2-Ethylhexyl) Phthalate，DEHP）属于邻苯二甲酸酯类化合

[4]物（AEs），是最常被使用的塑化剂，2011年5月起在台湾爆发的“塑化剂风波”，也正是由于检测出含DEHP

食品多达961项。有研究发现台湾5岁以下男性婴幼儿平均阴茎长度显著短于世界其他地区的儿童[5]，怀疑可能与塑化剂相关。为了验证DEHP的外生殖器毒性效应；故我们设计了本研究，观察DEHP诱导尿道下裂发生。 1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器设备

DEHP（分析纯，浓度>99%，上海化学试剂有限公司生产）；市售精制大豆油（金龙鱼，上海益海嘉里食品营销有限公司）；游标卡尺（0～150mm，上海恒胜工具有限公司生产），TP电子天平（最少量程0.01g，湘仪有限公司生产），JQ-1型通风柜（重庆劲旗科技发展有限公司），病理组织石蜡包埋机（BMJ-B型，常州中威电子仪器厂），自动固定脱水机（VIP-E300F-4897，日本政府赠送）。

1.2 实验动物选择和饲养

SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠，约10周龄，雌性40只，体重（260±10）g，雄性10只，体重（320±10）g，购自重

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庆医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（渝）2007-0001）。饲养于重庆医科大学附属儿童医院SPF实验动物中心（许可证号：SYXK(渝)2007-0016），空调房维持12h昼-夜间断性照明，保持室温（24±1）℃，相对湿度（45±5）℃，噪音85分贝以下，自动采食饮水。本研究遵从国际实验动物护理和使用指南。

1.3 染毒方式

经口灌胃染毒，DEHP溶于精制大豆油（溶剂）中，实验组包括低中高3个剂量组（分别为DEHP500，750和1000mg/kg bw/d），对照组为同期等量的市售精制大豆油，每日定时经口灌胃给药1.5ml/d。

1.4 实验设计

1.4.1 交配试验 上述SPF级SD成年大鼠，适应性饲养1周后，按1︰1比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天上午固定时间检查笼底有无精液栓，发现精液栓的当天确定为孕0d（Gestation day，GD0）。查到精液栓后，将受孕大鼠取出，完全随机分配至4个组，每组10只。

1.4.2 染毒和分组 SD孕鼠给予DEHP灌胃，剂量分别为0（对照组），500，750和1000 mg/kg bw/d，于GD12～19连续灌胃，每天1次。

1.4.3 称量和拍照 SD孕鼠以发现分娩当天确定为出生后0d（Postnatal day, PND0）。于PND1对新生仔鼠计数，并测量雄性新生仔鼠肛门至生殖器之间的距离（anogenital distance, AGD）和称体重，于PND30时，逐个检查雄鼠阴茎的弯曲度、尿道开口部位，判断有无尿道下裂[6]；并用COOLPIX S220相机微距镜头拍摄。

1.4.4 阴茎长度测量和组织病理学观察 PND30新生仔鼠，10%水合氯醛液腹腔注射麻醉（用量0.4ml/100g大鼠体质量），将新生大鼠仰卧位固定四肢于通风柜内，剪去阴茎皮肤周围毛发，用游标卡尺测量阴茎根部到阴茎顶端的垂直距离为阴茎长度。然后平阴茎根部切下整个阴茎，用4%多聚甲醛固定24hh，脱水，石蜡包埋，5μm横向切片得到标本，60℃烤片过夜，予以苏木精-伊红（HE）染色。取过标本的老鼠予以CO2安乐死。

1.5 统计学方法

实验数据用?2

±S表示，应用SPSS 16.0统计软件分析，完全随机设计的样本均数组间或组内两两比较采用t检验，两样

本率的比较采用χ检验，各组产期之间的比较采用随机设计的秩和检验方法。

2 结果

2.1 SD孕鼠GD12-19 DEHP暴露后雄性仔鼠尿道下裂模型结果及发生率的比较

由表1可见，随着DEHP灌胃剂量增加，孕鼠产期显著延迟（p<0.05）,当剂量增大至1000 mg/kg bw/d时，出现2只孕鼠因难产致死；同时，平均每窝产活仔数及产雄性活仔数在中高剂量组亦明显减少（p<0.05或p<0.001，见表1）。相对于正常对照组，DEHP灌胃组雄性仔鼠PND1时体重和AGD以剂量相关的方式呈显著下降或缩短（p<0.05或p<0.001），以及AGD/体重的比值和PND30时阴茎长度在中高剂量组也是如此。DEHP低中高剂量组诱导出雄性仔鼠尿道下裂畸形发生率分别为10.7%，30.6%和37.0%，相对于正常组差异显著（p<0.05或p<0.001）；且中高剂量组相对于低剂量组亦有显著差异（p<0.05），但在中高剂量组之间发生率未见差异（p=0.59）。

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