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基因工程

第一章 基因工程概述

1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史

基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建；

一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9）

4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)

第二章 分子克隆工具酶

5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)

概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT）

命名： 依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。

如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。

分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。

真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。

同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如： BamHI和BstI均可识别GGATCC。

同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如： TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC

星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）

7、大肠杆菌中甲基化酶的种类

①Dam甲基化酶，在序列GATC中A的N6位置引入甲基。

②Dcm甲基化酶 ，dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个C5甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。

③EcoKI甲基化酶；④SssI甲基化酶

8、依赖于甲基化的限制系统（McrA,McrBC,Mrr）

依赖于甲基化的内切酶E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统 ①mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。

②mcrB, C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。

③mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。 9、几个基本概念 DNA聚合酶，以单链DNA为复制模板，由5'端开始复制到3'端的酶。催化DNA的合成（具备模板、引物、dNTP等）及其相辅的活性。

反转录酶，依赖于RNA的DNA聚合酶,有5’-3’合成DNA活性,无3’-5’外切核酸酶活性（RNaseH水解磷酸二酯键，剪断mRNA，cDNA第二条链合成）。来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒)

RNA聚合酶，识别DNA中启动子特异序列，合成RNA，无需引物。 连接酶

①T4 DNA连接酶，反应底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA

②大肠杆菌DNA连接酶，活性与T4连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的参与，与平末端连接效率很低，不连接RNA。 ③Taq DNA连接酶，可连接dsDNA中的缺口间的两个寡核苷酸，需NAD+的参与，最适反应温度45-65℃。（VS TaqDNA聚合酶）

④T4 RNA连接酶，可使单链DNA或RNA之间相互连接，可用于标记RNA的3’末端，单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。 T4多核苷酸激酶& 碱性磷酸酶

T4多核苷酸激酶可将ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’末端。主要用于对缺乏5’磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。（探针）

碱性磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5’磷酸的反应，可防止DNA片段自连。

第三章 分子克隆载体

10、分子克隆载体必须具备的元件

① 在克隆载体DNA分子合适的位置应有1至多个克隆位点（MCS），供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子

② 克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或停留在细胞质中能自我复制，或整合到DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③ 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因 ④ 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。 11、表达载体必须具备的元件

克隆载体必备元件+启动子，终止子，核糖体结合位点RBS书本p86-87

12、标记基因的种类及作用原理 选择标记基因：

①氨苄青霉素抗性基因（ampr）

作用机理：Ampicillin可以抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，即抑制细胞壁肽聚糖的合成。 ampr编码一种可分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。(目的菌落周围出现散点菌落，即次生菌落，通过提高氨苄青霉素的浓度和控制培养时间≤12h减少次生菌落) ②四环素抗性基因（tetr）

作用机理：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位过程。

tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 ③氯霉素抗性基因（Cmr）

作用机理：氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。常用的cat基因编码氯

霉素乙酰转移酶，即一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在时，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。 ④卡那霉素（新霉素）抗性基因

作用机理：卡那霉素和新霉素是氨基糖苷类抗生素，都可与核糖体结合并抑制蛋白质的合成。该基因（kanr/neor）是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。 琥珀突变抑制基因supF 琥珀突变（书本p41） 筛选标记基因：

α -互补（蓝白斑筛选）：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酶的-α肽基因（lacZ’）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为~。

插入失活，某段DNA序列的插入，使得被插入的基因功能丧失功能，从而达到筛选的目的。 蓝白斑筛选：在lacZ’编码区上游插入一小段DNA片段，不影响β-半乳糖苷酶的功能互补。但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将不可避免的产生无α互补能力的β-半乳糖苷酶片段

13、λDNA的特点

λDNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端（cohesive end），且两者互补。进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。 14、λ载体的选择标记

lacZ基因，在填充片段中带有β-半乳糖苷酶基因片段 cI基因失活

cI基因：全面抑制并阻断裂解生长必须基因的表达，促进λ-噬菌体进入溶原状态。外源基因插入cI基因中，使E.coli进入裂解生长状态。 Spi筛选

野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。 Spi+ :λ噬菌体不能感染E.coli（P2）

Spi- :λ(red- gam-）噬菌体能感染E.coli（P2） 形成小噬斑

宿主：recA+ ；chi位点

第四章 人工染色体载体

15、人工染色体的种类和必备元件（概念PPT，结构，组成，筛选） 酵母人工染色体载体YAC、细菌人工染色体载体、P1载体和PAC载体 YAC（yeast artificial chromosome）克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体，能像染色体一样在酵母细胞中正常的复制。它是以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分： 一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS）；