内容发布更新时间 : 2024/12/24 7:41:42星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

IPProtocol

1.铺板：按一定细胞数将细胞接种于培养皿内，24h后进行处理。（转染质粒时，细胞长到90%以上较为合适。一次IP，使用6孔板足够。） 2.转染：lipo2000转染质粒，质粒转染效果应该提前验证。

（IP转染质粒时，被拽的一个蛋白可以适当加大转染量；如IP FLAG，用FLAG拉HA，总转染体系500ng时，对照组转空载质粒500ng；FLAG组转200ngFLAG＋300ng空载；HA组转300ngHA＋200ng空载；共转组300ngHA＋200ngFLAG。）

3.细胞裂解：将培养皿置于冰面，弃培养液，预冷PBS洗一遍。加入事先配置好预冷的lysis buffer ＋PMSF＋cocktail+Na3VO4等（如果是蛋白修饰反应需额外加）(6孔板每孔可加入1ml), 放置4℃摇床摇10min，裂解细胞。如皿底裂解不完全，可以用枪轻轻吹打几次。（裂解后皿底可见白色的丝状物，为DNA等成分。此步最好不要vortex。）

4．离心：4℃12000 rpm离心15min，上清即为裂解后的蛋白样品。

5. Beads准备：取出Beads(交联了IP抗体的Agarose Beads),使用前混合均匀。另取一只15ml离心管，根据每个样品1ml的用量加入相应的lysis buffer,然后以每个样品10-20ulBeads的量将Beads加入lysis buffer中，充分重悬后，分装至1.5ml EP管内，4℃ 1000-2000rpm 离心2min。弃上清（不要完全吸干，上样枪头）。

6. 将步骤4中离心后上清转移到新的硅化EP管内。 ① 每个样品各取出80ul做为input。

②IP：每个样品各取800ul上清加入事先备好的Beads中，放置于4℃转子上旋转充分孵育2h。

(孵育的时间需要调整，一般外源过表达IP 2-4H足够；若互作为底物反应，在IP前需要适当加入的MG132或其它相应的抑制剂。)

7. Beads的清洗：取出IP样品，4℃ 1000-2000rpm 离心 2min。弃上清。 清洗4遍：每个样品各加入1ml lysis buffer,放置于4℃转子上旋转10min，取出后4℃ 1000-2000rpm 离心 2min弃上清（每次不要吸干，保留一点点水分，最后一遍用压扁的上样枪头完全吸干水份）。

5、根据抗体说明书向上清中加入适当体积的抗体。4℃慢转2h。 说明：

1、IP 如果超声或裂解液内有强去垢剂，将会使蛋白质间的相互作用降低。 2、IP 所用抗体于IB所用抗体最好为不同种属。 3、一般在50KD位置会有抗体重链条带。

4、当做外转蛋白时需要加一组空载体对照，如单纯内源性蛋白的相互作用时需要加入IgG 空白组。 5、905配方：

Lysis buffer: 0.5%NP-40; 150mM NaCl; 50Mm Tris; HCl- PH7.5 Washing buffer: 0.1%NP-40; 150mM NaCl; 50Mm Tris; HCl- PH7.5 6.Yu Lab lysis buffer and washing buffer: RIPA buffer: Tris 50mM pH7.5, Nacl 150 mM， SDS 0.1%,

Na.Deoxycholate0.5 %， Triton X 100 or NP40 1%

1mM PMSF，RocheComplete Protease inhibitor