内容发布更新时间 : 2024/5/6 16:19:40星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
蛋白质印迹（Western blot）实验方案
溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。 Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液
150 mM NaCl
1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液） 150 mM NaCl
1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100 0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS（十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 Tris-HCl 缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.5 蛋白酶抑制剂
电泳、转膜、封闭缓冲液
Laemmli 2× 缓冲液/上样缓冲液 4% SDS
10% 2-巯基乙醇 20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl
测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸
0.1% SDS
测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。 转膜缓冲液（湿转） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 20% 甲醇
测定 pH，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。 转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris 39 mM 甘氨酸 20% 甲醇
0.04% SDS 封闭缓冲液
5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）
加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。
实验步骤
样品裂解
1. 制备细胞培养物裂解物
. 将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
. 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培
养瓶加入 1 ml；每 5×106 细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 ml）。
. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量
离心管中。
. 在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。
. 在 4 ℃ 预冷的离心机中以 16,000 × g 的转速离心 20 分钟。
. 轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管
中，弃去沉淀。
2. 制备组织裂解物
. 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样
品被蛋白酶降解。
. 将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样
品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃ 下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2 小时。
. 4 ℃ 下在微型离心机中以 16,000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心
管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。
样品制备
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取出小部分 (50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。 向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
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还原和变性：在 100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸 5 分钟，并进行分装。在 -20 °C 下保存裂解物。注意：分装细胞裂解物 (50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。
在 37 ℃ 下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以 16,000 × g 离心 5 分钟。
上样和电泳
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将等量的蛋白质和分子量标准上样到 SDS-PAGE 凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为 20 - 30 μg，纯化蛋白的上样量为 10 - 100 ng。
在 100 V 下电泳 1 至 2 小时。
可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。 凝胶百分比取决于蛋白质的大小： 4 - 40 kDa 20% 12 - 45 kDa 15% 10 - 70 kDa 12.5% 15 - 100 kDa 10% 25 - 200 kDa 8% 将蛋白质从凝胶转移到膜上 如下制备转移堆叠体：
膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。
所得膜可用于抗体染色。