内容发布更新时间 : 2024/12/23 19:42:56星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

一【原理】

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。

两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15min则被钝化。据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

二【仪器与用具】

分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管（25ml×13）；吸管（1ml，2ml，5ml各1支）；容量瓶（50ml×2）。

三【试剂】

1)麦芽糖标准液（1mg/ml）：称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；

2) 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；

3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：配制方法如下:

A液（0.1mol/L柠檬酸）—称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；

B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L； 取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液； 4) 1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

以下按论文顺序: 1材料

1.1材料取自大润发超市 1.2方法 1.2.1材料处理

发芽处理时，称取干种子40克，放在烧杯里用水浸润2小时以上，浸好后放在垫有纱布的培养皿上，种子上面再放浸湿的一层纱布，盖好，放在30度的培养箱里培养。每培养一天，要对种子及纱布进行水投处理。

1.2.2标准曲线测定 取试管7个编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0.0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后加蒸馏水使各管都达到2.0ml。再各加入3，5-二硝基水杨酸2.0ml，置沸水浴中5min，冷却后再用蒸馏水稀释至25ml，即再加蒸馏水21 ml。在520nm处测其吸光值（A）。

以麦芽糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作曲线，即为麦芽糖的标准曲线。 1.2.3 样品的测定

1.2.3.1酶液的提取 称取1g样品研磨成匀浆，取10ml蒸馏水用以研磨和洗涮研钵，移入离心管后在室温下放置15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。在3000rpm转速下离心5min，取上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。

1.2.3.2淀粉酶活性的测定 取4支试管编号，先取2支，测定α-淀粉酶活性,于每管中各加入酶提取液1.0ml。各管在70度恒温水浴中预热15min。取出迅速冷却。再取另2支，测定总淀粉酶活性,于每管中各加入酶稀释液1.0ml。在四个试管中均加入1.0mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。并均置40度恒温水浴15min，再分别在各管中加入40度预热的淀粉溶液2.0ml，混匀，立即放入40度水浴中保温15min，以促进酶促反应，再向各管中迅速加入4.0ml0.4mol/LNaOH，以终止酶的活性，然后准备测定。(为便于操作可参考下列表1)

再取各管的处理溶液2.0ml，放入25ml试管中，再加入2.0ml 3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀。置沸水浴中5min，冷却后再用蒸馏水稀释至25ml。在520nm处测其吸光值（A）。并将1和2管，3和4管计算平均值。

然后由此平均数值从标准曲线中查出相应的麦芽糖含量（mg）。 1.2.3.3计算

1）α-淀粉酶活性（麦芽糖mg/g鲜重5min）=α-淀粉酶麦芽糖含量×样品稀释体积/样品重（g）×显色时所用酶液体积

2）总淀粉酶活性（麦芽糖mg/g鲜重5min）=总淀粉酶麦芽糖含量样液稀释体积/样品重（g）×显色时所用酶液体积

附：样液稀液体积（α-淀粉酶为50ml,总淀粉酶为500ml）；样品重为1克。显色时所用酶液体积25 ml

附表1：淀粉酶测定操作步骤表 表1 淀粉酶测定操作步骤表 试管编号 酶提取液ml ．0 淀粉酶稀释液ml -- -- 1．0 -- 1．0 -- α-淀粉酶活性 1 12 1．0 总淀粉酶活性 3 4 70度恒温水浴中预热15min，取出迅速冷却。 pH5.6的柠檬酸缓冲液ml 40度预热的淀粉溶液ml 0.4mol/LNaOH溶液ml ．0 ．0 ．0 11．0 1．0 1．0 置40度恒温水浴15min 22．0 2．0 2．0 再置40度恒温水浴15min， 44．0 4．0 4．0 附表2：标准曲线测定数据记录表 表2.1标准曲线测定数据记录表 浓度 吸光度 附表3、4、5：三次样品测定数据记录及计算用表 表2.2 第一次样品测定数据记录表 试管编号 吸光值 平均值 α-淀粉酶 1 2 总淀粉酶 3 4 0.0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 查标准曲线得麦芽糖浓度，或用方程计算 据公式算出酶活性（麦芽糖mg/g鲜重5min） 表2.3 第二次样品测定数据记录表 试管编号 吸光值 平均值 α-淀粉酶 1 2 总淀粉酶 3 查标准曲线得麦芽糖浓度 据公式算出酶活（麦芽糖mg/g鲜重5min） 表2.4第三次样品测定数据记录表 试管编号 α-淀粉酶 1 2 总淀粉酶 3 4 α-淀粉酶酶活= 总淀粉酶酶活= 4 α-淀粉酶酶活= 总淀粉酶酶活=