质粒构建-protocol 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/3/29 21:30:14星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

一, 引物设计:

1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序(酶切位点的顺序一定不能颠倒)。

2,在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。 1, 使用word排除目的片段里含有的酶切位点,最后确定所使用的酶。 2, 设计引物:primer-up: 保护碱基 4 个 -- 上游酶切位点 ------- 首位20个碱基 Primer-down: ----- ------ 保护碱基4个 下游酶切位点 末尾20个碱基 的反向互补碱基 3, 核对----送公司合成。

4, 对公司合成的引物离心,10000rpm、5-10分钟、at 4℃,在超净台按照管子上标注的体积加入高压水(2dH2O),再把上游引物和下游引物混在一起,at 4℃保存。 二, PCR(P出目的片段): (一)、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段: 1,揺菌过夜: 2ul韩家淮实验室的菌液, 15ml 离 Xul相应的抗生素

心管 3ml LB 94℃ 5min 2,pcr: 菌液1ul 94℃ 30sec 2x PFU mix 25ul Pcr 温 度 体 58℃ 30sec Pcr(50ul)反Primer 1ul 系 72℃ X min

应体系 2d H2O 23ul 72℃ 5min

33cycles (X是根据片段的长度设定,500-1000bp/min,退火温度根据Tm值来计算,一般低于Tm值2℃) 3,跑胶、回收: (1),配胶:

称0.6g的琼脂糖 1%的琼脂煮沸3次 糖胶: 大块 加入60ml的1X TAE 加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时) 25分钟后,即可点样跑胶。 (2),跑胶:130-150V、25-30分钟左右。 (3),紫外灯下观察,切胶(要带防护手套和口罩)

4,做胶回收(天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒):

按照试剂盒的protocol来做,在胶回收的最后一步,Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴,并且在加过EB后,放在37℃温

箱中2min。

对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系:回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。 三, 酶切、链接:

1,目的片段酶切:(37℃酶切过夜或者4小时)

insert :上述胶回收产物 35ul

10 x H buffer(1.5x) 7ul

50ul的体系 dd H2O 6ul 酶1 1ul 酶2 1ul

2,载体酶切:(37℃酶切过夜或者4小时)

Vector (1ug/ul):2 ul

10 x buffer(1.5x) 3ul

20ul的体系 dd H2O 13ul 酶1 1ul 酶2 1ul

为方便以后使用,载体可以一次性多切点。

3, 酶切时,首先要核对一下酶的buffer,有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer,那么就要先切一端,酶切回收后再用另一酶切另一端,然后再酶切产物回收。 4,连接:

2x Rapid Ligation 6ul Vector 0.8ul

12ul的体系 insert 4.5ul

(目的是为了多加点insert) T4 DNA Lignase 1ul 四, 转化:

{感受态细菌10ul 质粒 10ul ⑴、冰上20分钟-→热激:42℃、90秒-→冰上2分钟 ⑵、加1ml SOC(或者1ml LB),37℃、180 rpm、45分钟。

⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素:LB=1:1000的比例加入抗生素,(100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄)。 ⑷、250rpm、过夜。

五, 质粒大抽:

六, 收菌:

取过夜菌至50毫升离心管,离心:6000g、3-5分钟、4℃。再重复一次,每管共收集100毫升过夜菌沉淀。(倒置于草纸上使液体流尽)。

七, 重悬:

每管加入8ml的RES-EF(RnaseA),重悬细菌沉淀—充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。

3,裂解:

每管加入等量的LYS-EF bufffer,即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次,(勿震!!)室温放置5min,使细菌完全裂解,溶液透明,无团块或絮状物。

注意:vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染

4,平衡:

⑴:滤芯插入柱子,将柱子驾于50ml离心管上(或者直接架于50ml离心管架上)

⑵:取15ml EQU-EF buffer 沿滤芯四周加入—充分平衡滤芯。

注意:①离心管内的液体不要浸没滤柱的头,所以要勤于倒弃滤液,②在过滤平衡液的同时,进行5、6步,防止滤芯干掉。 5,中和:

在等待EQU-EF buffer滤完时,往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer,颠倒混匀,冰上孵育5min。(不能vortex) 6,离心、过滤:

⑴:离心中和过的菌液:10000rpm、5-10min、at 4℃--质粒存在于上清中。 (离心使沉淀更加紧密,更集中于管底,对于进一步提高质粒质量会有所帮助)

⑵:将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。

7,洗一:

过滤完毕后,吸取5ml的FIL-EF buffer,沿滤芯四周加入(将粘在滤芯上的质粒洗下来)--过滤完后,将滤芯弃掉。

8,洗二:

往滤柱中加入35ml的ENDO-EF buffer—去内毒素 9,洗三:

待滤完后再加入15ml的wash-EF buffer—过滤。

10,洗脱:

取一支干净的15ml超速离心管,将滤完的柱子插入到离心管中,用高压条将二者绑好,往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer.

(Elu-EF buffer预先放在50℃的恒温箱中加热,可提高洗脱效率) 11,沉淀:

待Elu-EF buffer滤完后,弃滤柱,往离心管中加入5ml的异丙醇(将质粒沉淀下来),混匀

(充分vortex),静止10min---10000rpm、30min、4℃---弃上清。

12,洗涤:

加5ml的70%酒精(ETOH)或用15ml三蒸水(高压过)+35ml的无水乙醇配制(在超净台进行),混匀(上下颠倒即可),离心:10000rpm、10min、常温。 弃上清,重复上述步骤一次(再洗涤一次)弃上清---到超净台用200ul枪头把上清尽量洗净----再空离一次,在超净台用小枪头把液体洗净---吹干。 13,溶解:

取100-300ul高压过的H2O-EF溶解质粒--定量后,将质粒的浓度调至1ug/ul—最后,保存到-20℃。