内容发布更新时间 : 2024/5/18 15:26:14星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
GST亲和层析介质使用说明书
一、 简介
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。 二、 性能参数
特点 基质 吸附载量 介质平均粒径 最大流速 pH范围 使用温度 保存温度 保存液体 化学稳定性 基团密度高，载量大 6%的交联琼脂糖凝胶 ≥15mg GST融合蛋白（55kDa）/ml 100μm 300cm/h 3~10，在位清洗时pH范围可到2~11 常温 +4~8℃ 20%乙醇 室温下可在0.1M柠檬酸(pH 4.0)，0.1 M NaOH，70%乙醇或6M盐酸胍中耐受2h，蛋白结合能力不受影响 三、 适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、 操作说明 1. 缓冲液配制
缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。 缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧 化，需现用现配。
（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。 3. 装柱： 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述 玻璃层析柱
1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱：
1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质； 4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液； 5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗
如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。步骤如下： 1) 沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。 2) 疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇 (或2倍介质体积去垢剂，如 1% Triton? X-100) 清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。 6. 介质再生
每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，步骤如下：
1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH缓冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。
2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。 7. SDS-PAGE检测：
1) 不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围
分离胶浓度 6% 8% 10% 12% 15% 2) SDS-PAGE操作流程
分离范围 50～150kD 30～90kD 20～80kD 12～60kD 10～40kD
A. 每个胶孔最适蛋白上样量为5~10μg。
B. 将含5~10μg蛋白的样品溶液与loading buffer混匀，90℃孵育5min，取出后5000rpm离心1 min。 C. 上样，15mA、30mA恒流或80V、120V恒压电泳。 8.介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。 五、 GST Agarose分离GST融合蛋白实例
层析介质：GST 1ml；对照GST介质（国际领先品牌）1ml
样品：表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液
结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0 洗脱缓冲液：10 mM Glutathione（还原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0 流速：GST 1ml，0.5ml/min；对照GST介质1ml，0.5ml/min 实验结果：
色谱分析结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。 图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图
1.低分子量Marker；2.上样液； 3.GST-流穿液；4.GST-洗脱液； 5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液
1 2 3 4 5 6 图2 纯化后SDS-PAGE图
六、GST亲和层析介质使用注意事项
1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。
2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。 4.纯化后出现杂带的常见原因 1) 目标蛋白断裂或酶解
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等稳定剂。
2) GST融合蛋白不完全表达
GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。 5. 如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。 七、GST标签切除
GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST标签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与切除GST标签后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中的凝血酶。如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。