内容发布更新时间 : 2024/5/12 0:03:12星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

SDS-PAGE标准操作规程

一、 试剂 （一）储存液

(1) 2M Tris-HCl (pH8.8)，100ml 称取24.2g Tris碱； 加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH8.8(约加4ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高； 加蒸馏水至100ml。 (2) 1M Tris-HCl(pH6.8)，100ml 称取12.1g Tris碱； 加50ml蒸馏水；

缓慢的加浓盐酸至pH6.8(约加8ml)；让溶液冷却至室温，pH将会升高； 加蒸馏水至100ml。

(3) 10%(w/v)SDS，100ml。室温保存

称取10g的SDS； 加蒸馏水至总量为100ml。 (4) 50%(v/v)甘油，100ml

倒取50ml 100%的甘油； 加入50ml蒸馏水。 (5) 1%(w/v)溴酚蓝，10ml

称取100mg溴酚蓝；

加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解； 过滤除去聚合的染料。

（二）工作液

(1) 30%(w/v)丙烯酰胺/0.8%(w/v)双丙烯酰胺 30g丙烯酰胺 0.8g双丙烯酰胺

注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒素，操作时必须戴手套在通风柜操作，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，过0.45μm滤膜。可在4℃存放数月。

(2) 4×Tris-Cl/SDS (pH8.8 1.5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS) 91g Tris base

2g SDS

加水300ml，用1N HCl调pH至8.8，再加水至500ml过0.45μm滤膜，4℃存放

(3) 4×Tris-Cl/SDS (pH6.8 0.5M Tris-Cl Containing 0.4%SDS)

6.05g Tris base 0.4g SDS

加水40ml，用1N HCl调pH至6.8，再加水至100ml过0.45μm滤膜，4℃存放 (4) 10%过硫酸铵APS

0.1g过硫酸铵 1ml蒸馏水

长期不用应-20℃干燥分装保存，临用前再加D.W。 (5) 5×电泳缓冲液

15.1g Tris碱 72.0g甘氨酸 5.0g SDS 加蒸馏水至1L，pH应该在8.3左右。 (6) 5×样品缓冲液，10ml

0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8) 60mmol/L 5ml 50%的甘油 25% 2ml 10%的SDS 2% 0.5ml 2-巯基乙醇 14.4mmol/L 1ml 1%溴酚蓝 0.1% 0.9ml的蒸馏水

可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。 (7) 考马斯亮兰染色液

1.0g R-250 450ml甲醇 450ml D.W 100ml冰醋酸 (8) 脱色液

100ml甲醇 100ml冰醋酸 800ml D.W (9) 二、 步骤

1. 准备 先将电泳玻璃平板洗干净，用95%乙醇擦净，晾干，固定于平板固定架上。（注意：①高低板方向正确，底面要平，必要时可用凡士林封底；②玻璃平板固定高低时四个螺丝应依次适当旋紧，再装于固定器架） 2. 制胶

按如下顺序配制和添加试剂

D.W

30?ry/0.8%Bis 4×Tris-Cl/SDS (pH8.8) 4×Tris-Cl/SDS (pH6.8) Temed Ap(10%)

stacking gel T=4% C=2.6% 6.17 ml 1.33 ml

2.5 ml 5～7μl(一般6) 50～70μl(一般60)

10% 4.17 ml 3.33 ml 2.5 ml

separating gel

12% 3.5 ml 4.0 ml 2.5 ml 5～7μl 50～70μl

13% 3.17ml 4.33 ml 2.5 ml 7.5μl 75μl

注意：配胶时勿搅起气泡，先配好其它成分，在灌胶前用枪头分别吸好适量TEMED和AP后，再先加TEMED摇匀，后加AP，摇匀后灌胶。 3. 灌胶

① 插入梳子使梳子凹孔略低于低的平板，略低于梳子底沿处划好高度线，拿去梳子，Seperating gel从一固定位置（中部）快速倒入平板内至划线处，再吸取约1ml D.W缓缓注在Seperating gel面上（起压平胶面作用），静置约50mins待胶凝结； ② 倒出D.W，亦可再用滤纸小心地将残余水分吸干，插入梳子，沿一侧缓缓注入适量的Stacking gel（勿产生气泡），静置约20mins（其间可加入少量SDS电泳buffer防止蒸干）；

③ 移去梳子出现几个样品槽，用电泳buffer冲洗样品槽2遍。 4. 平板等装入电泳槽，加入电泳buffer淹没低板

5. 加样 将样品用适量的样品buffer稀释后煮沸三分钟，再小心地将样品加入电泳凝胶槽中，加样时不能用气泡。上样量要根据凝胶槽大小而定，过多会溢出到相邻孔而影响结果。

6. 走胶（约45mins-1hr）先低电压70V 20mA，待样品进入分离胶后再调高电压约140V 40mA直至指示色带到达平板底端，停止电泳关闭电源。

7. 染色脱色 倒去电泳buffer，自来水冲洗，取下凝胶，用考马斯亮兰染色，染色5-10min，脱色1hr左右。

三、

注意事项 常。

2. 过硫酸铵最好现配现用，若要留存一星期，必须冻于-20℃ 3. TEMED和丙烯酰胺是神经毒，操作时要小心。

1. 检查电极不要插反，开始电泳后要观察电极丝附近是否有气泡冒出，从而确认电流正