内容发布更新时间 : 2024/11/5 19:39:42星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤

一、 组织的研磨

准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、 裂解提蛋白

准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1

若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）

步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、 BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）

准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床

步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。 ②按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。 孔号 0 1 1 9 1 2 2 8 2 3 4 6 4 4 6 4 6 5 8 2 8 6 10 0 10 蛋白标准液（μl） 0 去离子水（μl） 10 蛋白含量（μg） 0

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl]

3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。

4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。

四、 SDS-PAGE蛋白质电泳 (一)、配胶

准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。

②首先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。

③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。

④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。

注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：

不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml） 溶液成分 H2O 30%Arcylamide 5 1.6 2.0 10 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15 4.9 6.0 3.8 0.15 0.15 0.006 20 6.6 8.0 5.0 0.20 0.20 0.008 25 8.2 10.0 6.3 0.25 0.25 0.010 30 9.9 12.0 7.5 0.30 0.30 0.012 1.0M 1.3 Tris-HCL(PH8.8) 10%SDS 10%APS TEMED

0.05 0.05 0.002

3.SDS-PAGE浓缩胶配方（5%Arcylamide）

不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml） 溶液成分 H2O 30%Arcylamide 2 0.68 0.17 3 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 4 2.7 0.67 0.5 0.04 0.04 0.004 5 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 6 4.1 1.0 0.75 0.06 0.06 0.006 8 5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 1.0M 0.13 Tris-HCL(PH8.8) 10%SDS 10%APS TEMED 0.01 0.01 0.001 4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂，应最后加入，加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间，防止其凝固。

(二)、电泳

准备：电泳仪、电泳缓冲液、样品、marker

步骤：①取1×电泳缓冲液，待浓缩胶聚合完全后，将胶架放入电泳槽内，将电泳缓冲液倒满内槽，内槽电泳液灌满后电泳液自动溢出灌满外槽，内槽电泳液低于外槽，拔出梳子，向梳子孔内加样。

②加样量为每孔8μl或10μl，如有剩余的孔，可加入等体积的1×loading buffer上样缓冲液，以防止样品胶跑歪。

③marker一般点在最左侧。 ④将电泳槽与电泳仪连接，打开电泳仪开关，恒压80V预电泳10min至溴酚蓝前沿到达分离胶，将电压调整到恒压120V，电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，注意不要让溴酚蓝跑出分离胶。

注意：1.电泳的条带依据蛋白的分子量而区分，分子量大的蛋白跑的慢，在上端。 2.电泳液可回收多利用几次，一周左右。

（三）、转膜

准备：甲醇、转膜缓冲液、滤纸、玻璃棒、海绵、PVDF膜或NC膜

步骤：①电泳结束后立即转膜防止蛋白分散，剪取一张与凝胶大小相仿的PVDF膜，2块海绵，6张滤纸。

②将PVDF膜用甲醇活化约3min，然后将膜、凝胶、海绵和滤纸放在盛有转膜缓冲液的托盘中平衡15min。

③取下凝胶用切片切取需要的部分，两端以marker和上样边缘为界，用转膜缓冲液冲洗凝胶几次，在湿转板黑色面放置一张海绵、三张滤纸，再放置凝胶，每一层都要用玻璃棒赶出气泡。

④从甲醇中取出活化的膜在转膜缓冲液中浸洗一下，放在胶上，正面朝凝胶，再放三张滤纸、一张海绵，每一层用玻璃棒赶出气泡，最后夹紧转移夹。

⑤转移夹正极板（白色）对着电泳槽红色面，放入电泳槽中通电转膜，恒压72V或恒流300mA。

注意：1.20KD以上的蛋白转膜时间约1h以上，100KD的蛋白转膜时间约1.5h左右，10KD左右的蛋白转膜时间为20~30min左右。

2.转膜要在冰水浴中进行，避免体系温度过高。

3.操作时要戴手套，用镊子夹持PVDF膜边缘防止划伤膜或染上杂蛋白。