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木本植物组培中的褐化研究进展

谢志亮* 吴振旺

（温州科技职业学院（温州市农科院），浙江温州，325006）

摘要：结合国内外的新研究进展，对木本植物组培中褐变产生的原因，影响褐变产生的因素，以及克服褐变的措施等方面进行了综述，以为更好地开展木本植物组培工作与科研提供借鉴和帮助。

关键词：木本植物；组织培养；外植体；褐变；研究进展

Research Progress of Browning in Woody

Plant Tissue Culture

Xie zhi-liang Wu zhen-wang

( Wenzhou Vocational College of Science & Technology(Wenzhou Vocational College of

Science & Technolog)，Wenzhou，Zhejiang，325006)

Abstract: Combined with the new research progress on browning of w、 plant tissue culture at home and abroad， expound the mechanism and factors causing browning and the prevention methods ， for better development of woody plant tissue culture work and research to provide the reference and help.

Keywords: woody plant；tissue culture；explant；browning；reserch progress

在植物组织培养中，外植体或培养物经常出现变褐死亡的现象就称为褐化，又称酚污染。褐化对诱导外植体的脱分化和培养物的再分化产生严重影响，是组培中存在的三大难题之一，也是木本植物组织培养能否取得成功的决定性因素。与草本植物相比，木本植物木质素、丹宁、色素等含量丰富，更容易发生褐化。因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素单宁或色素形成就多，而酚类物质含量与褐变发生具

[1]

有正相关性。因此，单宁含量或色素含量高的木本植物更容易发生褐变。

本文结合近些年有关本植物褐化的最新研究进展，探讨与分析木本植物组培中褐变产生的原因、影响因素及克服方法，以为同行提供参考。

1 褐变产生的原因

研究认为，外植体的褐变分为酶促褐变和非酶促褐变2种，酶促褐变是主导因素，但非酶促褐变也不能忽略。

1.1 非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞死亡(称为程序化

[2]

死亡)或自然发生的细胞死亡(称为坏死)而导致的褐化，不涉及酚类物质的产生。很多不

[3]

利条件都可以造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素。对于非酶促褐变，只要采取适当措施或者外植体适应了胁迫环境就可控制褐变的发生。

1.2 酶促褐变

酶促褐变主要由在相关酶系统的作用下引起的氧化反应。酶促褐变的发生须同时具备酶、底物和氧3个条件，组织内或伤口处分泌的酚类化合物在激活的多酚氧化酶作用下被氧

[4]

化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中的蛋白质发 *

谢志亮（1982-），男，硕士，讲师，从事园艺植物生物技术及生产技术的教学与推广工作，电话：(0577)88429211，E-mail:zlxie06@163.con

生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。引起褐变的酶主要有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PLA)等。底物主要是酚类化合物，目前鉴定出结构的酚类化合物已达数千种，按其骨架分为苯基羧酸类、苯丙烷衍生物类、黄烷衍生物类3类。

在正常发育的植物组织细胞内，多酚类物质分布在细胞的液胞内，而PPO则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布使底物与PPO不能接触，故不发生褐变。当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成

[5]

醌，再进行一系列的脱水、聚合反应，形成黑褐色物质，从而引起褐变。

2 影响褐变发生的因子 2.1 外植体材料

褐变与外植体的基因型、外植体年龄、取材时间、大小、部位、种类等有密切关系。 外植体基因型：植物的基因型影响褐变发生的频率和程度，不同物种之间褐化程度差异很大，就是同种植物的不同品种间也存在一定差异，因为不同基因诱导植物体内合成的物质

[6]

有差异。本地种褐化率比引进种要低。

外植体年龄：外植体年龄越老，木质化程度越高，褐化就越严重。一般幼龄材料褐变轻，

[7-13]

茎尖、叶片等高度分化的组织与成龄材料容易褐变。

外植体取材时间：外植体的褐变与取材时间（物候期）有密切关系。因为多酚氧化酶的活性与温度相关。夏季高温，外植体代谢活动强，多酚氧化酶的活性较高，褐化率也高；冬

[14][15-19]

春季则相反，褐化率较低。因此，在梨、柿、紫枝玫瑰、阿月浑子、自由人槭等木本植物的取材以温度较低的冬春季为好，褐化率低。

外植体大小：切口的大小决定酚类物质的被氧化面的大小，影响褐化的程度。外植体越

[20]

小，切面与体积的比率越大，伤害及褐变的程度就越大。在进行枇杷、苹果茎尖培养时，

[5，21]3

适宜的外植体大小有利于降低褐变。红豆杉愈伤组织的继代以0.7-0.8 cm较适宜，过

[22]

大或过小都易发生褐变。

外植体部位和种类：不同部位的外植体褐化率不同。一般树冠上部枝条褐化严重，下部

[23][22，24-26][18]

枝条褐化最轻。同一枝条顶芽（茎尖）比其他部位芽褐变要轻。但阿月浑子、软

[27]

枣猕猴桃枝条上部芽褐变较重，一定位置的芽褐变反而较轻。

[28]

外植体部分组织的去除也影响褐化。去除珠被的枣幼胚胚珠褐化率显著低于完整胚。

[22]

番荔枝去皮幼嫩茎段褐化最轻。这可能与去除部分组织内分泌的褐化物质多、易褐变有关。

外植体的水培：水培处理及处理时间与植物外植体的褐变也有关系。生长季节取材，随

[29]

水培时间的延长，外植体的褐变率呈下降的趋势。

外植体的消毒：不同的消毒剂种类对褐化的影响不一样。用升汞消毒的褐化率显著低于

[22]

氯酸钠处理的，可能与消毒处理时间长短有关，因为消毒处理时间越长，外植体就越容易褐变。

外植体的转移时间：外植体的转移时间与褐化也有关系。转移时间越短，越容易控制褐

[30]

变，沾化冬枣10d转接1次，无褐变现象发生，超过20d转接，褐化发生。

[31]

此外，在黄连木的培养中，外植体平放褐变比斜插、直插的轻。 2.2 培养条件

温度：温度对组织褐变影响比较大，因为植物体内酶活性和温度直接相关。低温抑制酚

[8][32][9]

类化合物的合成，降低相关酶(如PPO)的活性，减弱代谢速度，减少醌类物质的形成，

[33][34][18]

进而抑制或减轻褐变。低温条件下，对的抑制作用在“芭蕾”苹果、板栗、阿月浑子等褐变的抑制作用较轻。高温不仅不利于伤口的愈合，还会增强多酚氧化酶的生物活性，从

[35]

而加速氧化过程，使植物材料的褐变更为严重。但从低温下转入常温后褐变率高于一直在

[18]

常温下的培养。

光照：低光或暗处理能减弱褐化现象的发生。因为光照会提高酶活性，促进多酚类物质的氧化。在光照条件下，生长的植物体内酶活性较高，酚类物质在受光诱酶的参与下合成为

[36][37]

醌类物质。光照过强或光照时间超过16 h的外植体更会加快褐变。而在黑暗或弱光条件下生长，植株组织内受光诱酶的活性就大大减弱，酚类化合物的合成减少，其氧化产物酮

[39][9][18][22][32]

类也相应减少，使褐变得到控制。黑暗处理后，桑树、阿月浑子、番荔枝、苹果、

[39]

黑莓等的褐变明显降低。因此，接种前进行一定时间的暗处理对外植体褐化有一定的抑制

[34]

作用。但长期缺乏光照容易导致培养物叶绿素含量不足，生长不良。

光质不同，褐化的程度也不同。黄连木无菌苗在红光和白光下可正常生长，褐化率较低，

[31]

但在蓝光下，褐化率高且芽体伸长不明显。

光照强度与外植体褐化也有一定的关系。黑莓以1500lx光强下外植体的褐化率最低且腋

[39][40]

芽诱导率和生长状况均较好。霍霍巴光强低于1000lx时则褐化加重。

此外，CO2也影响外植体褐变的发生。高CO2会促进褐变。因为，CO2浓度过高引发细胞内

2-2+2+

积累过多的CO3，并与细胞膜上Ca结合而使有效Ca减少，导致内膜系统紊乱和瓦解，致使

[41][31]

褐变发生。但培养室内湿度对褐变没影响。

2.3 培养基：

在离体培养条件下，不同植物对培养基的要求不同，即使同一种植物在不同的培养基上其表现也不同。

培养基成分：无机盐浓度过高也会引起褐变，甚至加重褐化的程度。特别是在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高会引起酚类物质外溢，加剧褐变。而较低浓度的无机盐含量，

[42]2+2+

有利于防止植物材料褐化。培养基中Fe、Mn和cu等可作为氧化酶类的组成成分或辅因

[43-44][26]

子离子的浓度降低，酶活性也随着降低、从而抑制酚类氧化、减轻褐变。核桃、樱花[45][9][29][22]

、桑树、苹果、番荔枝等木本植物以大量元素减半的1/2MS或1/2DKW培养基抑制褐

[39][46-48][49]

变的效果好。但黑莓、红豆杉、银杏等则以高盐的MS为好。可见，无机盐浓度对外植体褐化的影响因植物种类而异。

培养基状态：培养基状态对褐化有一定的影响。从防止褐变的效果来说，纸桥培养基>

[29]

液体培养基>半固体培养基>固体培养基。因为液体培养中细胞溢出的有毒物质可以很快扩

[50]

散，而纸桥培养除了这一作用外，滤纸条还有吸附有毒物质的作用所以褐变最轻，相对而言对外植体伤害较轻。

培养基硬度：在一定范围内，随琼脂用量加大，培养基硬度变大，云桑、华盖木的褐变[9，23]

率降低。可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。因此，在允许的条件下，适当增加琼脂用量，增加培养基的硬度，从而降低褐化程度。

激素：培养基中不同的植物激素种类和浓度会影响外植体的发育和褐变酶活性，对外植体的褐变影响较大。细胞分裂素BA(BAP，6-苄氨基腺嘌吟)、KT(激动素)等具有提高PPO活性、

[9，30，51]

促进酚类化合物的合成的作用，随BA浓度的提高，褐化加重，褐化率提高。而生长素

[52]

类如2，4-D可延缓多酚合成，减轻褐变发生。此外，不同浓度激素的适宜组合也能不同程度地减轻或抑制褐化。戴维逊棉在MS培养基上加适量的BA，ZT，NAA培养能取得再生植株，

［53］

而在MS＋2，4-D，ZT，NAA上培养14d则全部褐变死亡。

pH值：低pH值可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率，抑制褐变。高pH值则明显加重

[35]

褐变。一般来说，pH值4.5-5.O的酸性环境不利于褐变过程的发生。

[54]

糖：糖也影响褐化发生的程度。果糖、葡萄糖能有效减轻褐化，麦芽糖次之，蔗糖[55][56]

较差，含杂质较多的市售白糖褐化最重。但糖的浓度应适宜，过高或过低均会加重褐[20，49]变。

其他：培养基中的附加成分也对褐化产生影响。水解酪白、谷胺酰胺、高浓度的氨态氮、

[2，20]

丝氨酸及硼都会加重褐化的发生。