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细菌的限制—修饰作用

核酸限制性内切酶的类型及主要特性

一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系

中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。

星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。

同位酶：识别位点相同，但切点不同。

同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。

同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端

两种DNA连接酶

（1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku

（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku

p35页表2-4

简述DNA连接酶的作用机制及其特点

说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤

基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等

质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。

共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（ oc构型） 线形DNA （L构型） 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。

理想质粒载体的必备条件：

A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数

B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因

D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围

蓝白班筛选原理

穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因

黏粒载体 也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体

噬菌体载体的优越性p69