内容发布更新时间 : 2024/6/6 18:04:54星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

三、《环境微生物学》和《大气污染控制工程》部分

实验一 水中细菌总数的测定

一、目的要求

l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材

l．培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。

2.仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

3.玻璃器皿的洗涤和灭菌 3.1玻璃器皿的洗涤

①新购置的玻璃器皿，因含游离碱，应先在此2%盐酸中浸泡数小时，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1-2次并沥干。

②培养细菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用热肥皂水或洗涤剂洗刷残渍，再用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1-2次，沥干。

③洗涤剂吸管量，可先置3%来苏液内浸30min或高压政策蒸汽灭菌，再用洗涤剂洗涤，用清水及蒸馏水冲洗干净。

④洗涤染色瓶时，可在5%漂白粉中浸泡24h后，再用常规方法洗涤干净。 ⑤含油脂的玻璃器皿，应单独高压灭菌洗涤，趁热倒出污物，置100℃干燥箱内烘0.5h，再放入5%碳酸氢钠水中煮沸，先去脂再行常规洗涤。

3.2玻璃器皿的灭菌 （1）高压蒸汽灭菌

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这是应用研究最广泛的灭菌方法，灭菌是用高压蒸汽灭菌锅进行。手提式高压蒸汽灭菌器，使用方便，其操作方法主注意事项如下：

①打开锅盖或从加入口处向锅内加入适量的水。

②加水后，将待灭菌器皿放入锅内，不要塞得过紧，以使锅内温度均匀，再将锅盖盖好，拧紧螺旋，使其密封。

③打开放气阀，打开热源加热至水沸腾，让锅内冷空气充分逸出。否则锅内温度达不到压力表所指示的对应温度，灭菌不彻底。当冷空气由排气孔排尽后，再关紧放气活塞。等锅内蒸汽压上升至所需压力时，控制热源，维持所需时间，一般为0.10343MPa(121℃)表压，保持20min。

④灭菌完毕，关闭热源，必须待压力自然降至“0”时，方可启盖取出灭菌物品，否则易发生危险。

（2）干热灭菌

实验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗干净的待灭菌器皿均匀放入恒温干燥箱内，便不得与内层底板直接接触。关闭箱门，开户电源开关，用恒温调节器，使温度上升至160-170℃，维持2h，即可达到灭菌目的。灭菌完毕后，需关闭电源开关，待温度降至50℃以下时，方可开门取物，否则玻璃器皿可因骤冷而爆裂。

4.培养基的制备

配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调节Ph、澄清过滤、分装、灭菌、鉴定等步骤。

①调配：按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿中称量，然后加水移入培养基中。此外，也可放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨等极易吸潮物质，在称取时动作要迅速。此外，维生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配制高深度的贮备液，在配制培养基过程中再按配方比例取一定量加入培养液中即可。

②融化：将各成分混匀于水中，最好以流通蒸汽融化0.5h，如在电炉上融化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。融化后，应注意补充失去的水分，补足至原体积。

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制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热融化，但不可用锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。

③调节pH值：一般细菌用的培养pH调整在6.8-7.2之间，但也有需要酸性或碱性的培养基。培养基高压灭菌后，pH值约降低0.1-0.2，故调节时应比实际需要的pH值高0.1-0.2。但有时也可降低0.4，因所使用的灭菌器不同而不同。调节pH值，用盐酸和氢氧化钠，因为在相同pH值下，有机酸比无机更易抑制微生物生长，因此，除非特殊情况，最好不要用乙酸等有机酸来调节pH值。一般用精密pH试纸调节（精确到0.1pH单位），必要时也可酸度计。调节时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。

④过滤澄清：培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透明方可使用。液态培养基常用滤纸过滤；固态培养基如琼脂培养基，加热后需趁热用脱脂棉或多层纱布过滤。

⑤分装：将调节pH值后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。

基础培养基一般常分装于三角瓶内，分装的量应根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，以便灭菌后使用。

琼脂斜面分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3。

半固体培养基分装量约占试管长度的 1/3，灭菌后趁热直立，待冷却凝固。 高层琼脂分装量约为试管长度的1/3，灭菌后直立凝固待用。

琼脂平板是将灭菌后的培养基，冷却至50℃左右，在无菌条件下倾入灭菌平皿内。内径9cm的平皿倾注培养基约15ml左右，使培养基平铺于皿底部，凝固后即成。倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。 新制成的培养平板，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣置于37℃培养箱内约30min，待平板干燥后使用。

⑥灭菌：加热配制培养基后，在2h内进行了灭菌处理。不要把未灭菌的培养基冷藏或存放。绝大多数培养基都应放在高压灭菌器内于121℃灭菌，并应在达到这一温度后持续15min。糖类液态培养基或含有其他特殊成分的培养基，

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高压蒸汽灭菌会使其分解，一用滤膜过滤灭菌。或者将不耐热物质用其他方法灭菌（如流通蒸汽灭菌）后，再加入已灭菌的培养基中。

⑦保存：配制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤配制为宜。每批应注明制作日期。已灭菌的培养基可在4-10℃存放1个月。存放时应避免阳光直射，并且要避免杂菌浸入和液体蒸发。

当发酵管中的液体培养基存放在冰箱或者适中的低温时，可能有空气溶解进去，以致在37℃培养时，会在管内形成空气泡。因此，凡存放在低温的发酵管，使用前应先予以培养过夜，弃去有气泡的管子。

液态培养基在室温下存放超过一周，可能有水分蒸发，如果管内液体损失10%，应弃去不用。

5.各种培养基的成分与制备

为减少配制中的误差，尽量选用市售已配好的综合培养基。 （1）营养琼脂培养基

蛋白胨 10ｇ 牛肉浸膏 3ｇ 氯化钠 5ｇ 琼脂 15-20ｇ 蒸馏水 1000ml

将上述成分混匀后，调节pH为7.4-7.6，过滤去除沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌15min，贮存于暗处备用。 （2）乳糖蛋白胨培养液

蛋白胨 10ｇ 牛肉浸膏 3ｇ 氯化钠 5ｇ 乳糖 5ｇ 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml

将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氧化钠加热溶解于1000 ml蒸馏水中，调节pH为7.2-7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min，贮于暗处备用。

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此培养基适用于检验大肠菌群时作发酵试验用。根据实际需要，也可按上述配方比例（除蒸馏水外）配成二倍、三倍或五倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。

（3）品红亚硫酸钠培养基（多管发酵用） 蛋白胨 10ｇ 乳糖 10ｇ 琼脂 20-30ｇ 磷酸氢二钾 3.5ｇ 无水亚硫酸钠 5ml 蒸馏水 1000ml 5％碱性品红乙醇溶液 20 ml

①贮备培养基：先将琼脂加至900 ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至1000 ml，调节pH为7.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min。贮于暗处备用。 ②平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1：50的比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中；再按1：200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡红色为止（不宜多加）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此种培养基适量（约15 ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 （4）伊红美蓝培养基（ERB培养基）

蛋白胨 10ｇ 乳糖 10ｇ 琼脂 20ｇ 磷酸氢二钾 2.0ｇ

蒸馏水 1000ml 2％伊红（曙红）水溶液 20ml 0.5％美蓝（亚甲基蓝）水溶液 13 ml

①贮备培养基：先将琼脂加至900 ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至1000 ml，调节pH为

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