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紫外可见光谱法研究EGCG的稳定性
作者：李邦玉 吴媛 吴虹燕 刘臣 来源：《江苏农业科学》2015年第07期
摘要：考察绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯在多种体系中的稳定性。通过柱色谱分离纯化绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）产品；采用紫外可见分光光度法定性研究温度、时间、酸碱、紫外光、溶剂等对EGCG稳定性影响，以及EGCG分别与H2O2、DPPH·的反应。研究结果，温度、时间、酸碱、紫外光等都不同程度影响EGCG稳定性，紫外可见光谱跟踪到了H2O2、DPPH·与EGCG的反应。
关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；稳定性；紫外可见分光光度法 中图分类号：TS201.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0294-03 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶所含儿茶素中含量最多的功能成分。因为含有多个酚羟基，EGCG具有很强的抗氧化活性，医药工业上应用于抗菌、抗癌、抗衰老等治疗，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性[1-3]。在食品工业中EGCG应用于抗氧化、保鲜、祛臭等产品，日化工业中作特殊功能添加剂等[4]。但是在含茶叶的食品、药品和饮料的加工和储藏过程中，EGCG易受到温度、金属离子、酶和pH值等因素的影响，极易发生化学变化，从而改变了其原先的结构和生物活性[5-7]。因此考察EGCG的稳定性很有必要。本试验采用紫外可见分光光度法，定性研究不同环境条件下EGCG的稳定性。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器
EGCG对照品（南京广润生物制品，98%），DPPH·（Sigma 公司生产）、无水乙醇、30%过氧化氢、盐酸、氢氧化钠、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇，以上药品皆为国产分析纯试剂。绿茶为苏州东山碧螺春茶厂提供。
紫外可见分光光度计：型号UV-1801；十万分之一天平：CPA 225D；电热恒温水浴锅；三用紫外分析仪：WFH-203，上海精科实业有限公司；P230 型高效液相色谱仪：配有P230+紫外检测器；P230/P230p高压恒泵；EC2000 色谱工作站：大连依利特分析仪器有限公司生产；RUC-5200型超声波清洗机：上海睿祺公司生产。 1.2 试验方法
1.2.1 EGCG的分离提纯 取绿茶10 g，置于250 mL容量瓶中，加入95%乙醇150 mL，80 ℃超声提取30 min，提取2次，合并提取液，过滤、80 ℃减压回收乙醇，所得浓缩液上聚
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酰胺树脂，以乙醇-醋酸梯度洗脱，薄层层析跟踪检测，收集EGCG部位流分，脱色、浓缩、重结晶，得EGCG纯品，液相色谱法检测产品成分与纯度。
1.2.2 浓度对EGCG的影响 依次量取浓度为501.4 μg/mL EGCG储备液 0.10、0.20、0.32、0.49、0.64 mL于25 mL的比色管中，添加无水乙醇至10 mL，配制浓度分别为8、12、16、24、32 μg/mL的梯度溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。
1.2.3 温度对EGCG溶液的影响 分别吸取浓度为 501.4 μg/mL EGCG储备液2 mL于4支25 mL比色管中，添加无水乙醇至10 mL，制成同浓度的溶液，分别放入室温、40、60、80 ℃温度的水浴锅中30 min，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。
1.2.4 时间对EGCG溶液的影响 分别吸取EGCG储备液2 mL于5支比色管中，添加无水乙醇至10 mL，制成同浓度的溶液，将其中4支比色管放入80 ℃水浴锅中，分别在1、3、5、7 h后扫描吸收曲线，剩下1支不加热作为原液进行对比。
1.2.5 紫外灯照射对EGCG溶液的影响 分别吸取2 mL EGCG储备液于6支25 mL比色管中，添加无水乙醇至 10 mL，制成同浓度的溶液，将其中的5支比色管置于照射频率为254 nm紫外灯下照射，照射时间分别为20、40、60、320、400 min，留1支比色管不照射紫外光作为对照，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。
1.2.6 pH值对EGCG溶液的影响 分别吸取0.5 mL EGCG储备液于3支25 mL比色管中，再加入4 mL水，编号1、2、3，1号作为对照液进行定性扫描，向2号比色管中逐滴加入010、0.25、0.40、0.55、0.70、0.85 mL盐酸（0.01 mol/L），分别定性扫描后与原液对比；向3号比色管中逐滴加入0.1、02、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL氢氧化钠（0.01 mol/L），分别定性扫描后与原液对比。
1.2.7 溶剂对EGCG溶液的影响 分别称取EGCG 0.25 mg，转入25 mL比色管中，分别加入水、己烷、乙酸乙酯、四氯化碳、三氯甲烷、甲醇、乙醇定容至25 mL，配制成浓度为10.0 μg/mL EGCG溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。
1.2.8 H2O2与EGCG溶液的反应 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG储备液至25 mL比色管中，不断滴加0.04 mol/L的过氧化氢溶液，连续扫描其紫外吸收光谱图。
1.2.9 EGCG与DPPH·的反应 量取4 mL 0.1 mmol/L EGCG储备液至25 mL比色管中，不断滴加0.1 mmol/L的 DPPH· 乙醇溶液，连续扫描其紫外吸收光谱图。 2 结果与分析
2.1 液相色谱法检测EGCG产品成分及含量
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摸索得到的色谱分离条件为：色谱柱：Shimpak C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.2）；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量5 μL。纯化的样品及EGCG对照品色谱如图 1、图2。EGCG 纯度大于97%。 2.2 浓度对EGCG溶液的影响
由图3可知，EGCG在210、276 nm处都有吸收峰。从a到e，随着EGCG溶液浓度升高，EGCG在276 nm处吸收峰位置不变且随着EGCG浓度增大而逐渐升高，可以作为其特征吸收，只是浓度过低时不显著。而在200～220 nm处吸收峰不稳定，随浓度增大而发生红移，所以该处吸收不能作为其特征吸收。 2.3 温度对EGCG溶液的影响
对4组100.2 μg/mL EGCG溶液，分别考察其在室温、40、60、80 ℃的水浴锅中加热30 min后的变化，用紫外-可见分光光度计进行定性光谱扫描。从图4可以看出，随着温度的升高，EGCG溶液吸收曲线基本形状没有变化，只是吸收强度随温度的升高逐渐减弱，说明该浓度的EGCG溶液加热时发生了部分降解，温度越高降解程度越大。王静等发现即使在0 ℃氧化2 min，EGCG的氧化程度也会达0.3[7]。 2.4 加热时间对EGCG溶液的影响
从图5可以看出，80 ℃下放置一段时间后，EGCG溶液吸收曲线大体形状没有改变，276 nm处特征吸收峰位置没有变化，吸光度值随放置时间延长而增大，1～5 h内，吸收峰升高且趋于稳定，而7 h后吸收强度再次大幅增加。276 nm处吸收强度增大应该与EGCG浓度增大没有关系，可能是其他类似物质大量产生引起的。吴平等研究了不同温度热处理的EGCG，发现EGCG的氧化产物比较复杂，无法进行定量分析[8]，有待进一步研究。 2.5 紫外灯照射对EGCG溶液的影响
从图6可知，EGCG经一段时间紫外光照射后，其吸收曲线基本形状没有明显改变，随着照射时间延长，276 nm处特征吸收强度逐渐降低，可能是EGCG在紫外光照射下逐渐发生某种降解的缘故。
2.6 酸碱对EGCG溶液的影响
由图7可知，EGCG溶液中加入不同量的盐酸后，溶液颜色没有变化，其光谱图基本形状也没有明显变化，从276 nm特征吸收处观察，随着加入盐酸的量逐渐增多，276 nm处吸收强度降低幅度逐渐增大，但是总体幅度不大，说明EGCG在酸性体系中是相对稳定的，随着酸性增强稳定性逐渐有所降低。陈利燕等将不同酸度（pH值分别为2.6、3.6、4.6、5.6）的儿茶素溶液在25 ℃放置18 h后，儿茶素的含量都有所减少，而EGCG是8种儿茶素组分中最稳定的[6]。