内容发布更新时间 : 2024/5/27 2:37:34星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定

一、硝酸还原酶的测定

[原理]：

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂]

1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液； 2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；

3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；

4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；

5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；

6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；

7． 30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]；

1. 标准曲线制作： 试剂（ml） 管 号 亚硝酸钠标准液 蒸馏水 1%磺胺 0.02%萘基乙烯胺 每管含亚硝态氮（ug） 1 2 3 4 5 6 7 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。

2. 样品中硝酸还原酶活力测定

1. 在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2. 称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中

1份作对照，另外2份作酶活性测定用。

3. 反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml

0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。

4. 比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入

1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm

5. 空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。

结果计算

x单位鲜重样品中硝酸还原酶活性?v?v1 [μg/ (g .h)]

2W?t式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ；V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。

二、谷氨酰胺合成酶的活性的测定

【原理】

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1

。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 【仪器与用具】

冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 【试剂】

提取缓冲液：

0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；

反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）： 内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；

反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：

反应混合液A的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4；

显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；

40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。 【方法】

1.粗酶液提取 称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。

2.反应 1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。

4.原始数据记载

结果计算：

A GS活力(A·mg﹣1 protein·h﹣1)＝P?V?t

式中 A—540nm处的吸光值；

P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T—反应时间（h）。