内容发布更新时间 : 2024/7/8 19:54:23星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
生物化学实验讲义
实验一 蛋白质的颜色反应与沉淀反应
蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白物质的定量测定的依据。
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
实验材料与仪器
鸡（或鸭）蛋白
吸管0.5 ml（×1）、1ml（×3）、2 ml（×2）、5ml（×2） 滴管
试管1.5×15cm（×10） 水浴锅 电炉
吸滤瓶500ml（1） 布氏漏斗
试剂
1. 卵清蛋白液：将鸡（或鸭）蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 1%苯酚溶液：苯酚1ml，加蒸馏水稀释至100ml。
3. 1%白明胶液：1g白明胶溶于少量热水，完全溶解后稀释至100ml。
4. 米伦（Millon）试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（比重1.42），水浴加温助溶，溶解后加二倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。
5. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 6. 尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。
7. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。 8. 浓硝酸：比重1.42
9. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 10. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。
11. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml，加硫酸铵至饱和。 12. 95%乙醇 13. 结晶氯化钠
14. 2～3%醋酸铅（或AgNO3）：2～3g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 15. 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于蒸馏水并稀释至100ml 16. 饱和苦味酸溶液
17. 1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。
主要内容
（一）米伦氏反应
1. 用苯酚实验：取1%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦氏剂约0.5ml，小心加热溶液即出现玫瑰红色。
2. 用蛋白溶液实验：取2ml蛋白溶液，加入0.5ml米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀。小心加热，凝固之蛋白质出现红色。
3. 用白明胶（也是一种蛋白）做上述实验，结果如何？ （二）双缩尿反应
1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩尿，释出之氨可用红色石蕊试纸检测。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再
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生物化学实验讲义
加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
2. 另取一只试管，加蛋白液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，是否出现紫玫瑰色。
注意硫酸铜不能多加，否则产生深蓝色的干扰络离子。 （三）黄色反应
于一试管内，置蛋白溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加入10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。 （四）茚三酮反应
取1ml蛋白溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意此反应必须在pH5～7进行。 （五）蛋白质盐析作用
1.取蛋白质溶液5ml于试管，再加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。
2. 将上述混合溶液过滤，滤液中加入硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （六）酒精沉淀蛋白质
取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。 （七）重金属沉淀蛋白质
取试管2支各加入蛋白质溶液2ml，一管内滴加2～3%醋酸铅（或AgNO3），另一管内滴加1%硫酸铜溶液至有沉淀析出。 （八）生物碱沉淀蛋白质
取试管2支各加入2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4～5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管中加入饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。
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实验二 双缩尿法测定蛋白质浓度
具有两个或者两个以上肽键的化合物皆有双缩尿反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。
仪器
容量瓶10ml（×6）
试管1.5×15cm（×8） 吸管5ml（×3）、 2ml（×1） 721分光光度计
试剂
1. 双缩尿试剂：将0.1750gCuSO4·5H2O溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶，加入30ml浓氨水、30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
2. 卵清蛋白（或酪蛋白）液：约1g卵清蛋白（或酪蛋白）溶于100ml0.9%NaCl溶液，离心，取上液，用凯氏定氮法测定其蛋白含量，根据测定结果，用0.9%NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 3. 未知液：可用酪蛋白配置。
主要内容
1. 标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液
编号 1 2 3 4 5 6 2mg/ml乱清蛋白液 （ml） 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 蒸馏水 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 蛋白浓度 （mg/ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号分别加入上述不同浓度的蛋白溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩尿试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。
2. 样品测定：取未知浓度的蛋白质3.0nl置试管内，加入双缩尿试剂2.0ml，混匀，测定540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。
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实验三 酵母核糖核酸（RNA）的分离及组份鉴定
酵母核酸中RNA的含量较多，DNA少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙 醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组份。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组份的存在。
实验材料与仪器
干酵母粉（市售） 鲜酵母 PH试纸 天平
烧杯100ml（×1） 量筒50 ml（×1）、10 ml（×1） 抽滤瓶500 ml（×1）、布氏漏斗Φ10cm（×1） 吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1） 离心机5000r/min
试剂
1. 0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 2. 乙酸（AR） 3. 95%乙醇
4. 无水乙醚（CP） 5. 氨水（CP）
6. 10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倒入水中，稀释至100ml。 7. 5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 8. 苔黑酚-三氯化铁试剂
主要内容
1.RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液20ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（试纸检测），离心10~15分钟（4000r/min）。取上清液，加入95%乙醇30ml，边加边搅。加完静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml），再用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可做鉴定。
2. RNA组份鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸溶液5ml，加热至沸1~2分钟，将RNA水解。
1．嘌呤碱：取水解液2ml加入浓氨水2ml，然后加入约1ml 5%硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱 的银化合物沉淀。
2．核糖：取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放 沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
3．磷酸：取一支试管，加水解液1ml和定磷试剂1ml。在水浴中加热，观察溶液是否变成兰色，说明磷酸是否存在。
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