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植物组培中污染发生原因及防治技术研究进展

彭立群1 田子珩1 张俊琦2*

1 北京林业大学林学院 北京 100083；2 北京林业大学公共分析测试中心

摘要: 从植物组织培养技术污染的概念和途径以及有关灭菌方法，目前常用的和最新的研究进展等方面进行归纳综述，正确地认识到污染带来的危害以及造成的原因,提出控制污染的可行途径和有效措施，强调组织培养中应严格遵守无菌操作规程，并阐明作者的见解，为科研和生产提供一定的参考。

关键词：植物组织培养 污染 防治

Research Progress in Contamination Causes and Prevention Measures in the Process of Plant Tissue Culture

Pengliqun1 Tianzihang1 Zhangjunqi2

(1. Forestry institute of Beijing Forestry University，北京，100083； (2. Public analysis and test center of Beijing Forestry University)

Abstract: This paper summarized and reviewed the concept, pathway, present and the latest

researches on sterilization methods in respect of plant tissue culture. Correctly recognizing harm caused by contamination and the reasons for the formation, proposing effective ways and possible measures to control contamination, emphsizing the importance of strict compliance on the aseptic operating procedures in tissue culture, and expounding the author’s point, providing a certain reference for scientific research and production.

Keywords: plant tissue culture, contamination , prevention

植物组织培养技术是二十世纪初发展起来的一门新兴技术，在科研和生产应用上拥有越来越重要的地位。但由微生物所引起的污染问题一直是制约当前植物组织培养技术发展的主要障碍，对植物种苗的规模化生产、植物试管基因库的构建、生产成本和宝贵材料保全等方面都产生了负面影响。如何解决这个问题已经引起这一领域科研人员的重视，研究微生物污染的种类、来源和消毒方法以及一些抑制剂种类和用量的筛选，对避免和减轻污染，提高培养成功率和培养物的成活率，降低成本，提高经济效益等都有重要意义。

本文针对在植物组织培养中污染产生的原因及控防措施等相关问题的研究进展作出简要综述，并结合实践经验提出的一些见解，以期为从事植物组织培养研究与应用的相关人员提供一些技术借鉴和参考。

项目基金：北京市大学生科学研究与创业行动计划（101002203）。

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作者简介：彭立群（1993.3 -），女，安徽，本科在读，梁希理科实验班。通讯作者:张俊琦，博士，实验师，从事植物生物技术教学与研究，E-mail: zjq2001_0_0@163.com。

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1 污染的概念和造成污染的主要原因

1.1污染的概念

植物组培污染是指植物组织材料在组培过程中因培养条件下的温度、湿度、pH值和营养条件等适合微生物的生长，从而导致在各培养环节中发生的培养体系污染。这些污染一般出现在材料表面、材料附近的培养基以及培养基的其他部位，表现为霉变或混浊或云雾状、粘液状、发酵泡沫状等不同形状、颜色和大小的污染痕迹[2]。

1.2 污染的原因

组织培养过程中的污染是研究工作者感到最棘手的问题，也是影响植物组织培养中种苗成败的关键因素。一般来说，在植物组织培养过程中，细菌污染率高于霉菌污染率，占总污染率8O%以上。大多数人认为在组培中较常见的细菌性潜在污染可能是由器具消毒不彻底，带有半致死性细菌引起。而细菌污染中的内生细菌污染情况却更为复杂，所以选择适宜的外植体材料至关重要。

屈云慧、杨春梅等研究认为造成污染的主要污染源有真菌、植物病原细菌、病毒和类病毒以及螨或蓟马。真菌来源于空气，可以产生孢子，落于适当的环境中便会迅速增殖形成菌落,污染整个培养容器。植物病原细菌常分布在外植体表面或内部, 病毒和类病毒则常存在植物内部,并利用机械或载体传播。螨是一类寄生在植物或动物体上刺吸液汁或血液的节肢动物，体形微小，蓟马是一种靠植物汁液维生的昆虫。螨或蓟马来源于培养间墙壁、角落，具有活动能力,喜欢吃菌丝，如果不注意培养室的卫生，则培养容器内部很容易就会受到感染。 Leifert 等[3]认为植物的组织培养中细菌引起的污染是最严重的，而外植体却常常被多种杂菌同时侵染。

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1.2.1 材料带菌 材料带菌是污染中重要而又难以避免的污染途径，这一方面与外

植体的种类、大小、生长环境、取材部位、取样时间有关；另一方面也与外植体的灭菌方法有关。通过研究发现，通常从一种外植体中可分离到的杂菌有数种至数十种，这种内生菌多样性现象在热带植物中尤为突出，甚至可达数百种。

Leifert C 等[3] 认为细菌污染的主要来源有三个: （1）材料内部灭菌处理不彻底, 这样造成的污染占污染总数的1/3～1/2；（2 ）在正常的灭菌条件下, 内生菌有时也能存活，这样的污染占污染源的1/4；（ 3 ）来自寄主植物的污染占1/4～1/2。JennetBlake 等[4] 认为牧草虫和螨的体表带有霉菌的孢子和细菌, 在九、十月份是重要的污染源，会造成材料带菌，发生组培污染。Reustle G等[5]也认为8月和9月牧草虫的大量繁殖阶段造成了组培污染

的严重发生。Enjalric F等( 1988) 在对三叶胶初级培养污染的研究中发现高温、多雨的环境更有利于污染的发生, 而且随着植物材料年龄的增长, 植物材料的健康状况不断恶化, 组培污染也会更加严重。

尚宏芹认为内源菌污染是由于外植体材料内部的微生物所引起，不能被一般的表面消毒方法所清除，而是随着材料带入培养过程造成危害。

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1.2.2 实验操作和培养环境引起的污染 除了外植体带菌，操作过程和培养环境

也是引起污染的主要原因，主要表现为（1）无菌室灭菌不彻底或超净工作台滤出的空气中带菌超标；（2）培养基灭菌不彻底；（3）交叉污染；（4）工作人员操作不当导致的污染。

无菌室灭菌不彻底就会产生寄生虫和其他带菌生物，而昆虫媒介会将环境中的真菌孢子转移到材料中，进一步导致材料污染。

培养基灭菌不彻底而发生的污染主要由细菌和真菌引起。细菌污染表现为: 培养基表面出现黏液状物质、菌落或呈浑浊的水渍状甚至泡沫发酵状, 这其中以芽孢杆菌引发的污染最为普遍和严重, 呈现乳白色,或以滴形云雾状存在于培养基内。这种菌外被夹膜，能耐一定的高温、高压, 对紫外线有一定的抗性[8] 。真菌污染表现为：培养容器内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块，以曲霉、毛霉和青霉属真菌最为常见，此时，如果菌落只存在于培养基表面，则也有可能是由于培养容器的瓶塞、瓶口包扎松弛，使培养室空间中弥散的真菌孢子进入容器内引发污染

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交叉污染是指接种用具灭菌不彻底，接种时由于材料自身带菌，部分未污染材料与污染材料一起接种或一起培养从而导致未污染材料污染。或者是未及时发现污染苗，使真菌孢子随空气污染到其他培养基等。

由于无菌操作不当而导致的污染更不可忽视。首先，进行无菌操作的工作人员本身即是最大的带菌者，其衣服、毛发、手等都隐藏着大量的微生物；其次，工作人员使用了未经充分消毒的工具(镊子、剪刀、烧杯、培养皿等)；同时在进行操作时由于呼吸时排出的大量细菌以及因手碰到器皿边缘或不慎接触材料，都会导致增加污染的机会。

2 主要防治措施

真菌性污染可通过严格的消毒措施及改善培养环境等来克服，而对于细菌性污染除要求操作人员严格按照无菌操作规程操作外，对外植体带菌引起的污染，还应结合预防内源性污染的对策，从而把污染率降低到可以接受的范围，来提高组培苗的质量和产量。

2.1 培养材料的污染防治