内容发布更新时间 : 2024/12/26 21:48:35星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理

PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。PCR反应过程有以下3个步骤：①变性。将反应体系混合物加热到94 ℃，维持较短时间（大约15 s-30 s），使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。 ②退火。将反应体系冷却至特定的温度（引物的TM值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板引物复合物。 ③延伸。将反应体系的温度提高到72 ℃并维持一段时间，引物在耐热聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以4种单核苷酸（dNTP）作为底物合成新的DNA链。以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数十次，从而使目的基因得到指数级扩增，达到检测或获取基因的目的。 2 PCR仪的分类

根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。 2.1普通PCR仪

一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。

主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。 2.2 梯度PCR仪

一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。

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梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。 2.3原位PCR仪

（有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通过替换模块进行多用途开展实验工作）

是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。

2.4 实时荧光定量PCR仪（fluorescencer quantitive polymerase chain reaction, FQ",PCR)

在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。

荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道；有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。

实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。

实时荧光定量PCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。 实时荧光定量PCR的优势

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荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，但是成本太高。

样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。 三.特点和优势

1．特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。

2．灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。

3．避免污染：全封闭反应，无须PCR后处理。

4．实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。 5．高效低耗：可实现一管多检。

6．操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质。 7．快速：反应时间<1.5小时。 四．实用意义：

1．提高检测效率，缩短检测周期，提高通关速度； 2．降低检测成本，提高经济与社会效益。 进口RT-PCR仪器优点：

一是国产的一般系统软件和硬件不是很匹配，二是国产的售后服务差，三是不是很稳定。国外用的好的是ABI公司的仪器，它具有稳定性好，灵敏度高的优点。

FQ",PCR 在预防兽医学研究领域的应用

自PCR 技术问世以来, 病原体的检测能够快速、方便的进行。由于PCR 技术假阳性率太高, 只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果, 这并不能完全作为诊断依据, 只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。因此对模板准确定量显得特别重要。而应用荧光定量就能快速、准确

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