内容发布更新时间 : 2024/11/20 10:47:05星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
以琳生物
Ni-NTA纯化系统
一 树脂和柱的特性
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Ni-NTA Agarose是用Ni离子预处理过的,显兰色, Ni-NTA Agarose和纯化柱有以下特性: 结合能力:5-10 mg蛋白/ml树脂 平均孔径大小:45-165微米 建议洗涤速率:0.5ml/min 最大线形洗脱速率:700cm/h 最大压力:2.8psi(0.2bar) 柱子的材料:聚丙烯
PH稳定性:长期3-13,短期2-14 二Ni-NTA树脂
Ni-NTA Agarose可将任何含有6个组氨酸标签的载体在细菌,昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达融合蛋白纯化,树脂有高亲和力并能选择性结合六个组氨酸标签的重组融合蛋白。
担保可以在正常、变性或复合条件下利用Ni-NTA Agarose进行纯化，结合到树脂上的蛋白可利用低PH缓冲液或用咪唑与组氨酸竞争而被洗脱下来。
三 正常条件同变性条件
对六个组氨酸标签蛋白的纯化是应用正常条件还是变性条件取决于蛋白的可溶性及是否需要保留蛋白的生物学活性。
正常条件：蛋白裂解后期在上清中是可溶性的，并想要保持蛋白的活性
变性条件：蛋白裂解后在溶液中，是不可溶性的，并且后期工作不依赖于蛋白的活性
复合条件：蛋白是不可溶性的，并且想要保留它的活性，准备裂解物和柱子在变性条件下，然后利用正常缓冲液在洗脱阶段以复性蛋白。 注：此过程不能恢复所有蛋白的活性。
方法
一制备细胞裂解物
㈠准备材料
1 正常结合缓冲液在正常条件下制裂解物用 2 超声裂解物
3 10ug/ml RNase 和5ug/ml DNaseⅠ（盐酸胍裂解液） 4 盐酸胍裂解缓冲液（由试剂盒提供），用于在变性条件下制备裂解物 5 18号针头
6 离心机，无菌的蒸馏水 7 SDS-PAGE样品缓冲液
8 用来制备细菌裂解物的溶菌酶
9 Bestation或 Leupeptin 用于制备哺乳动物裂解物
㈡制备细胞裂解物—正常条件下
1 5000rpm 5min离心50ml培养液，弃上清，留菌体沉淀，用 8ml Native Binding Buffer重悬菌体。 2 加8mg 溶菌酶，冰浴30min
3超声处理,冰浴进行,超声10-15秒停止,再10-15秒超声,停止,为一个循环,共6个循环即可,或按以下方法进行处理:
冰浴中用等强度超声处理2-3个,10-15秒振荡,然后迅速将裂解物放入液氮或甲醇于冰中冷冻并迅速融化裂解物至37℃重复以上的超声----冷冻----融化的过程2次以上。
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4（可选项）如裂解物粘性很大，加入RNase（10ug/ml） 和DNaseⅠ（5ug/ml）冰浴10-15分钟（或用18号针头的注射器反复吸、吹几次） 5．3000 g 15min 离心 取上清至另一管中
注：此法只适用于可溶性的融合蛋白的纯化。
6．取5 ml裂解物用做SDS-PAGE分析，冰浴或-20℃保存裂解物，准备好后，进行正常条件下的纯化。 ㈢制备细菌细胞裂解物—变性条件下
1． 平衡盐酸胍裂解缓冲液至pH7.8, 37℃ 2． 5000rpm 5min 离心，50 ml菌液，收获沉淀 3． 用1中的盐酸胍裂解缓冲液8ml重悬沉淀 4． 缓慢搅动细胞5-10min 室温进行 5． 超声裂解，高强度5s/次，共3次
6． 3000g 离心，15min 离去细胞碎片，回收上清
7． 取5ml用语SDS-PAGE分析，其余冰浴或-20℃保存备用。 ㈣昆虫细胞的制备---正常条件下
1．8ml Native Binding Buffer含有0.5 ug/ml的leupetin,leupetin是一种蛋白酶阻遏子 2．收获已高浓度表达的昆虫细胞，用1中的Native Binding Buffer 8ml重悬细胞沉淀 3．通过两个冻融循环裂解细胞，冻融用液氮或干冰乙醇浴融，采用42℃水浴 4．将裂解物用18号针头反复吸吹4次以去除DNA 5．3000g 15min离心，将上清移至另一新管中 6．取5ml用做SDS-PAGE，其余-20℃保存备用。 ㈤昆虫细胞的制备----变性条件下
1． 收获细胞后用8ml盐酸胍缓冲溶液重悬沉淀 2． 18号针头反复吸吹裂解物，共4遍 3． 3000g 15min 离心，上清移至另一管中
4． 取5ml用做SDS-PAGE，其余-20℃保存备用。 二 纯化过程
㈠在变性条件下的纯化
以变性条件下的方法制备变性缓冲液柱子和细胞裂解物，确定pH正确。 1.准备材料
Denaturing Binding Buffer
Denaturing Wash Buffer Ⅰ pH6.0 Denaturing Wash Buffer Ⅱ pH5.3 Denaturing Elution Buffer 注:(1)保证pH正确
(2)变性缓冲液中含有尿素随时间过去pH将会升高 2.Ni-NTA柱的制备
⑴重悬Ni-NTA Agarose轻轻倒置晃动
⑵取2ml树脂加入柱中,重力法或低速离心法使树脂沉淀下去,轻轻吸去上清 ⑶加6ml灭菌蒸馏水,反复倒置以重悬树脂 ⑷沉淀树脂,小心移去上清
⑸6ml Denaturing Binding Buffer ⑹重悬树脂,轻轻倒置晃动 ⑺沉淀树脂, 小心移去上清 ⑻重复5-7步
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3.变性条件下的纯化
利用变性缓冲液,柱子和细胞裂解物,过程如下: ⑴加8ml 裂解物至已制好的柱中
⑵室温条件下轻轻地搅动(或震荡)使之结合15-30min,使柱中的树脂始终处于悬浮状态,重力法或低速离心法(800g 1min)使树脂沉淀,小心吸去上清.
⑶用4ml Denaturing Binding Buffer重悬树脂,晃动2min,重力或低速离心沉淀沉淀树脂,小心吸取上清,4℃保存上清液,用做SDS-PAGE分析,重复1次以上.
⑷用4ml Denaturing Wash Buffer pH6.0 重悬树脂,晃动2min,重力或低速离心沉淀树脂,小心吸取上清，4℃保存,用做SDS-PAGE分析, 重复1次以上.
⑸用4ml Denaturing Wash Buffer pH5.3重悬树脂,晃动2min, 重力或低速离心沉淀树脂,小心吸取上清，4℃保存,用做SDS-PAGE分析, 重复2次以上.
⑹垂直固定好柱子,打开底部的小盖,用5 mlDenaturing Elution Buffer洗脱蛋白.取1ml洗液,OD280检测洗液,之后将所有洗液于4℃透析,透析过夜以除区尿素浓缩透析后的洗液
如果仍用此柱纯化同样蛋白,用0.5M NaOH洗树脂30min.用相应的结合缓冲液平衡,若想再生树脂方法如下: 树脂再生:
建议树脂的再生不要超过3次,并且只用来纯化相同的重组蛋白,如树脂因为Ni的洗失而变白,则再生树脂,再生纯化柱中的2ml树脂
⑴用8ml 50mM EDTA洗柱2次,以洗掉螯合的Ni2+ ⑵用8ml 0.5M NaOH 洗柱2次,每次摇2 min ⑶用8ml无菌去离子水洗柱2次
⑷用8mlNicl26H2O溶液(5mg/ml), 洗柱2次 ⑸用8ml无菌去离子水洗柱2次
⑹加0.02%叠氮化物或20%乙醇作为保护剂,盖好或封严柱子,室温保存 ㈡正常条件下
注:试验前比武检所有试剂的pH是否符合要求 1. 纯化用缓冲液
5×Native Purification Buffer Native Binding Buffer Native Wash Buffer Native Elution Buffer 2. 所需材料
5×Native Purification Buffer 3M 咪唑
NaOH,HCl ,灭菌去离子水 制备Ni-NTA柱子 已制备的细胞裂解物
3. 制备Ni-NTA
⑴将Ni-NTA Agarose在瓶中重悬，轻轻地反复倒置小瓶，温柔混合
⑵取1.5ml树脂至10ml的纯化柱中,让树脂靠重力沉下去(10 min)或通过低速离心(800g,1min)而后轻轻地吸去上清。
⑶加6ml灭菌蒸馏水重悬，树脂通过反复倒置轻轻敲打柱子，注意一定要轻。 ⑷通过重力或低速离心法使树脂沉下去，小心吸去上清。 ⑸加6ml Native Binding Buffer 重悬树脂。
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