内容发布更新时间 : 2024/11/19 17:38:56星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
[讲解]DNA与RNA的提取与注意事项
DNA提取
以玉米为例的dna提取注意事项及方法。。。。 DNA提取以及DNA提取的注意事项
1、 裂解液要预热加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、苯酚具有高度腐蚀性～飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤～因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发～具有神经毒作用～操作时应注意防护。5 m: d! o8 g% {3 ^* \\酚一定要碱平衡。 3、 各操作步骤要轻
4、 取各上清时,少许即可
5、 异丙醇,乙醇等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。 6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、 用大口滴管或吸头操作～以尽量减少打断DNA的可能性。
8、 要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。 9、 避免剧烈吸打DNA～不能搅动基因组DNA。
10、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
11、 吸取基因组DNA时～要用专用的粗口吸头～普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。% c# `% F+ R* A2 Z- g
12、 基因组应4度保存～如-20度保存可能导致DNA断裂。. 13、 在准备实验的过程中～应将DNA样品放在碎冰上。 14、 用Tris缓冲液溶解DNA。
15、 加缓冲液后～为了加速DNA溶解～可以轻轻晃动或轻弹试管。 16、 加入缓冲液后～置于4度过夜～也可以溶解DNA。
17、 将DNA溶液65度温育10分钟～可以灭活。
18、 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚～说明其中蛋白质含量较高～可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
19、 酚抽提时如果上清液太粘稠～无法进行水相转移时～可加入适量TES稀释后再抽提
玉米是重要的粮、经、饲兼用作物～同时还是制药、淀粉糖浆、油料、酒精工业的主要原料～种植面积仅次于小麦和水稻～是世界第三大作物～我国玉米种植面积和总产量都居世界第二位。在世界及我国的经济生活中具有非常重要的地位和作用。然而～随着植物科学向分子水平的深入发展～玉米选种、育种、改良和鉴定等研究中经常需要获得有效的植物DNA样品。因此如何提取玉米的DNA是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作～如不能有效地完成玉米DNA的提取～那就无法进行分子生物学方面的实验。玉米DNA的有效提取～它是进行任何玉米研究工作的前提和基础～也是最关键的一步。
自Marmur于1961年建立用十二烷基硫酸钠,SDS,和氯仿从细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来～研究者一直在探索能制备DNA制品的最佳方案。迄今为止国内外报道的植物DNA提取
[1]~[4][2]、[5]方法多达好几十种～如十六烷基三乙基溴化铵,CTAB,法、十二烷基硫酸钠,SDS,法、简易操作方法、高盐低pH法、碱裂解法、Zigenhagen法、Dneasy plant li-ets法、S法、脲法、Draper and Scott法、Cscl gradient 法、CTAB/Cscl gradient法、苯酚法、DNA pengent法、
采用基因释放剂提取DNA的方法、采用试剂盒提取DNA的方法等。下面就几种玉米常用的DNA提取方法进行详细综述。
1.CTAB法～是一种去污剂～可溶解细胞膜～它能与核酸形成复合物～在高浓度盐溶液中(0.7mol/LNacl)是可溶的～当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/LNacl )
时～从溶液中沉淀～通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB与核酸的复合物
再加入乙醇使核酸沉淀～CTAB能溶于乙醇。CTAB法能很好地去除糖类沉淀溶解于高浓度盐溶液!
[1]杂质～对于含糖较高的材料可优先采用。程备久等在1996年～就采用玉米鲜叶不经干处理直接用CTAB法提取DNA～其分子量和纯度均较高～可用于限性切、基因文库构建及基因组分析等。
2、SDS法。利用高浓度的SDS在较高温度,55，65?,条件下裂解细胞～使染色体离析～蛋白质变性～释放出核酸～然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀～最常用的方法是加入5mol/L的KAc于冰上保存～低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物。离心除去沉淀后～上清液中的DNA反复用酚/氯仿抽提～用乙醇沉淀水相中的DNA。
3、采用试剂盒提取DNA。所谓DNA提取试剂盒是指包含了提取植物DNA所需的试剂,能直接用于提取高质量的DNA。
4、简易操作方法。简易操作方法是通过优化CTAB法与SDS法等几种基本方法的操作步骤～试剂用量与作用时间所建立的一种改良的DNA快速提取方法。
综上所述～在玉米基因组DNA的提取上的研究取得了令人瞩目的进展～随着分子生物学实验技术的发展～DNA提取方法也在逐步完善～操作步骤更加简单、成本更低、得到DNA的产量和质量也越来越高。在玉米遗传多样性研究 、分子标记辅助选择 、转基因后代的检测 、分子标记定位、纯度鉴定等遗传育种领域具有更广阔的应用前景。
RNA的提取注意事项
RNA抽提纯化是分子生物学研究的基本工作内容。但是由于RNA酶的广泛存在和难以灭活的顽固本性～使得RNA的抽提纯化和后续工作特别困难。虽然Trizol