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实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术 指导教师：张建丽 姓名：高熹学号：1120152430

细菌鉴定中常用的理化生化反应

一、实验目的

1)了解细菌生理生化反应原理 2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。

3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

二、实验原理

1）糖（醇）类发酵实验

因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。

2）甲基红（Methyl red）实验（MR实验）

大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色 。

产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上, 故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。

3）伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验)

4）靛基质(吲哚)实验

大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。

5）硫化氢实验

某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验。

6）明胶液化实验

某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性。

7）淀粉水解实验

细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色。

8）柠檬酸盐利用实验

产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐, 培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色.

三、实验试剂及器材

实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌平皿、杜氏小管、接种环,酒精灯；

微生物材料：大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面； 试剂：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂 格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液； 培养基：

葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验） 胰蛋白水培养基（吲哚实验）

柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验） 明胶培养基（明胶液化实验） 淀粉培养基（淀粉水解实验）

柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验） 硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）。

四、实验步骤

1）糖（醇）类发酵实验

1. 编号： 在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号.

2. 接种： 取3 支葡萄糖发酵培养基, 1 支接种大肠杆菌，1 支接种变形杆菌,

留1 支不接种，作为对照.

3. 乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37℃ 培养箱中培养24h.

4. 结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH 降低, 培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。

2）甲基红实验（MR 实验）

1. 取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。

2. 取1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌,1 支不接种，作为对照。37℃培

养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果。

3. 结果：呈现红色者为阳性, 呈现黄色者为阴性。 3）伏-普实验(V.P.实验)

取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1 支留作对照。37℃培养48h 取出,加入40% KOH 5-10 滴,然后再加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃培养箱中保温15-30min 加快反应速度.若培养物呈现红色,为伏-普反应阳性。

4）靛基质(吲哚)实验

取3 支胰蛋白胨水培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1 支留作对照。37℃培养24-48h 后, 沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面, 观察结果.呈现玫瑰红色为阳性,不变色为阴性。

5）硫化氢实验

取3 支醋酸铁或柠檬酸铁半固体培养基，采用穿刺接种法，1 支接种大肠杆菌，1 支接种变形杆,1 支作对照。37℃培养24h 观察结果,若有黑色沉淀线出现为阳性。

6）明胶液化实验

取3 支营养明胶培养基，用穿刺接种方法，1 支接种大肠杆菌，1 支接种枯草杆菌，1 支作对照。37℃培养48h 后，将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30 min,观察明胶的液化情况。若明胶不凝固者，表明其已被细菌液化,是为阳性结果。

7）淀粉水解实验

1. 将冷却到50℃的淀粉培养基以无菌操作制成平板。

2. 用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边,再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。

3. 置37℃温箱培养24h。

4. 打开培养皿, 将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板.如菌苔有透明圈出现,表明淀粉已被水解.透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的大小。

8）柠檬酸盐利用实验

取3 支柠檬酸盐斜面培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种产气杆菌，1 支作对照。37℃培养24 h 观察结果.培养基变深蓝色者为阳性.培养基不变色,则继续培养5-7 天,培养基仍不变色者为阴性。

9）硝酸盐还原实验

取3 支硝酸盐培养基，1 支接种大肠杆菌，1 支接种枯草杆菌，1 支作对照。37℃培养18-96h,每天吸取培养物2ml 加格里斯试剂A 液和B 液1 滴,出现粉红色,玫瑰色,橙色或棕色为阳性.如无阳性反应,可加入1-2 滴二苯胺试剂,如培养液呈蓝色,则表示培养液中仍有硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其它物质,仍按硝酸盐还原阳性处理。

五、实验结果及分析

（一）糖（醇）类发酵实验：37℃培养24h，葡萄糖（图一）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：产酸产气。乳糖（图二）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：无明显变化