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凝胶层析法测定蛋白质分子质量

1 实验目的

了解凝胶层析的原理及其应用，通过测定蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。

2 实验原理

层析技术分离物质是利用混合物中个组分的物理化学性质（溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，使之通过一个互不相容的两相体系，由于混合物中个组分在两组之间的分配比例不同，就会以不同速度向前移动而分开。

凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、渗透层析、分子筛层析等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中，测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。

分子质量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小则Ve值大，Kav值大。 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav和lgMr成线性关系：Kav=-blgMr+C其中b，C为常数。 同样可以得Ve=-b’lgMr+C’, 其中'b、'C为常数。可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。

3 实验仪器和实验试剂

3.1 实验材料

3.1.1 标准蛋白：蓝色葡聚糖-2000 Mr=2000KD，牛血清白蛋白Mr=67KD，胰蛋白酶Mr=36KD，Cytc Mr=13.7KD 3.1.2 Sephadex G-75

3.1.3 洗脱液：0.025mol/L Tris-HCl-KCl，PH7.5 3.2 实验器材

3.2.1 玻璃层析柱:柱管1.2×50cm 3.2.2 紫外分光光度计 3.2.3 自动部分收集器 3.2.4 刻度试管

4 实验操作 4.1 凝胶柱的制备

4.1.1 凝胶的选择和处理

凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。

4.2.2 装柱

柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液然后在搅拌下将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中使之自然沉降待凝胶沉降约2—3cm后打开柱的出口调节合适的流速使凝胶继续沉集待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱关闭出水口。接着再通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布以防将来在加样时凝胶被冲起并始终保持凝胶上端有一段液体。新装好的柱要检验其均一性是否均匀，用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱或将柱管向光照方向用眼睛观察看是否均匀有无“纹路”或气泡。

4.2 用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质分子质量

4.2.1 上样与洗脱

上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，吸去柱上端的洗脱液，使残余液体降至与胶面相切但不要干胶，关闭出水口。用滴管吸取1ml标准蛋白蓝色葡聚糖小心地绕柱壁一圈距离胶面2mm缓慢加入然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中打开出水口开始收集待溶液渗入胶床后关闭出水口。按加样操作，用少量(约1ml)洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3.2ml/4min流速开始洗脱。

当上一个标准蛋白洗脱到柱体1/3处左右，便可加第二个标准蛋白牛血清清蛋白1ml，操作与上相同，再依次加入胰蛋白酶1.5ml，Cytc1ml。 4.2.2 标准曲线的制作

用紫外分光光度计逐管测定A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白的洗脱体积Ve。 以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱曲线。 以Ve为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线。

5 实验数据处理

5.1 标准蛋白的洗脱曲线

5.1.1自动部分收集器设定：3.2ml/4/管(测定标准蛋白) 。 5.1.2 洗脱液A280吸光度测定数据，见表1。