内容发布更新时间 : 2024/5/20 8:21:10星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

第二节 分子生物学技术

学习导航 明目标、知重点难点 尝试PCR(多聚酶链式反应)技术的基本操作。(重、难点) 体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点) 理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点) [学生用书P56])

一、阅读教材P83分析使用PCR仪的安全措施

1．严禁在PCR仪运行过程中打开池盖，否则会造成仪器的永久损坏。 2．仪器运行时，样品池及池盖内表面温度较高，当心灼伤。 3．仪器运行时，加热器内腔为高温、高压环境，严禁触及。

4．仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音，请立刻停止运行，检查是否有微量离心管断裂等故障。

5．仪器运行过程中如果没有反应，请切断电源，进行检查。

6．必须保持样品池内部的清洁，可用蘸有体积分数为95%的酒精棉签擦拭相关部位。 7．仪器必须放置在PCR实验室里，操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定，做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。

8．当仪器接通电源后，打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害，因此，在进行任何调整、替换、保养或维修之前，请切断所有的电源。

二、阅读教材P84完成多聚酶链式反应程序

1．物质准备：向离心管中加入模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。 2．变性：在 94 ℃高温下，作为模板的双链DNA解旋为单链DNA。

3．退火(复性)：反应体系的温度降至 55 ℃，引物与单链DNA上的特定部位相互配对。 4．延伸：反应体系的温度回升到 72 ℃左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。

三、阅读P85～87分析目的DNA片段的体外扩增与鉴定 1．DNA片段的PCR扩增

(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2 mL PCR微量离心管等。

(2)在0.2 mL PCR微量离心管中加入 5_μL_10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 μL，1_μL模板DNA，5_μL引物1和5 μL引物2，29_μL双蒸水。

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(3)煮沸 5_min之后冰浴 2_min，低速离心，按照1单位/μL加入TaqDNA聚合酶。 (4)扩增DNA片断的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在 94_℃的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94_℃，30_s→55_℃，30_s→72_℃，1_min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为 72_℃，1_min。

(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。 2．DNA分子的测定

(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。

(2)条件：在沸水浴中加热。 (3)现象：出现蓝色现象。

判一判

(1)DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。(×) (2)DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶的参与。(×) (3)DNA延伸过程需要TaqDNA聚合酶的作用。(√) (4)所有PCR中使用的引物都是相同的。(×) 连一连

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多聚酶链式反应[学生用书P57]

多聚酶链式反应技术又叫PCR技术。通过PCR技术就可以在体外对DNA的特定片段进行快速的复制，并获得大量的目的基因。结合教材P84内容完成以下探究。

探究1 结合图示理解PCR反应的过程及结果 (1)PCR反应过程

①变性：当温度上升到94 ℃左右时，双链DNA解旋为单链(如图)。

②退火：系统温度下降至55 ℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(如下图)。

③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。

(2)结果

①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。 ②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 探究2 结合教材，推算PCR扩增数目的理论值

理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有 2个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2个DNA。

讨论解旋酶、DNA聚合酶与DNA连接酶的作用？

提示：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较

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