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研究生课程考核试卷

（适用于课程论文、提交报告）

科 目：细胞生物学实验及研究方法 教 师： 宋关斌 姓 名： 学 号：

专 业： 生物学 类 别： 学硕 上课时间： 年 月 至 年月 考

生 成 绩：

卷面成绩 平时成绩 课程综合成绩

阅卷评语：

阅卷教师 (签名)

重庆大学研究生院制

重庆大学生物工程学院2014级硕士生 《细胞生物学实验及研究方法》课程考核

1. 试结合你感兴趣的领域，以某种细胞为研究对象，依据本学院的实验条件设计一个1年期的小课题。请简述立题依据和拟选取的研究内容和研究方法。（20分） 答：目前癌症的发病率越来越高，其中肺癌的发病率更是居高不下，因而以人肺癌细胞A549为研究对象。立题依据：核因子κB（ nuclear factor-κB，NF-κB）是一种作用十分广泛的真核细胞转录因子。近年来的研究显示核因子-κB（ nuclear factor-κB，NF-κB）的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移。基质金属蛋白酶（ matrix metalloproteinases，MMPs）由肿瘤细胞分泌，能够分解细胞外基质中的Ⅳ型胶原。肿瘤细胞在侵袭的过程中必须穿过富含Ⅳ型胶原的细胞外基质，才能扩散到身体其他部位，因此MMPs 在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要的作用。但是对于NF-κB 活性的改变对肺癌细胞株 A549 细胞侵袭能力是否也有影响，目前尚无相关研究报道。研究内容：用表达 IκBα的真核表达质粒 pcDNA3.1（+）/IκBα转染体外培养的 A549 细胞，以抑制 A549 细胞的 NF-κB 活性，观察 NF-κB活性降低A549 细胞侵袭能力以及对 MMPs 表达的影响。研究方法：①构建表达 NF-κB 抑制物α同分异构体（ inhibitor of NF-κ B，αisoform，Iκ Bα ）的真核表达重组质粒 pcDNA3.1（ +）/IκBα 。 ②体外培养 A549 细胞， 分为未转染组（ 不转染质粒） 、 转染 pcDNA3.1（ +）组、 转染 pcDNA3.1（ +） /IκBα组，分别转染相应的质粒。 ③ 应用 RT-PCR、 Western blot检测各组细胞 Iκ Bα的表达情况，应用凝胶电泳迁移率改变实验（ electrophoreticmobility shift assay， EMSA） 检测各组细胞 NF-κ B 的活性， 应用 Transwell 侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力，应用 RT-PCR 方法检测各组细胞 MMP-2、 MMP-9 的mRNA 水 平 ， 应 用 明 胶 酶 谱 法 检 测 各 组 细 胞 基 质 金 属 蛋 白 酶-2 （ matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（ matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的活性。

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2. 你认为近几年在细胞生物学研究领域有哪些值得关注的新技术？简述其原理和应用价值？（20分）

答：①在蛋白质的检测方面，2012年年底《Nature Method》中提到了一种基于质谱的定向蛋白质组学技术-SATH（Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions,SWATH）技术。原理：SWATH技术根据待分析的目标蛋白氨基酸序列，选择对应的蛋白质特异性肽段及蛋白质特异性肽段对应的高响应子离子，最后用高响应子离子的信号强度来反映该蛋白质的表达丰度。此方法将原来用的普通三重四级杆质谱仪进行改造，用一个高分辨率的TOF质量分析器代替第三个低分辨率的三重四级杆（即四级杆飞行时间杂交质谱仪），并连续运行32个25Da 宽的离子分离窗口，对每个窗口内的离子进行全碎裂。利用碎片离子谱图库来挖掘，碎裂多肽二级谱中特定多肽的特征碎片离子，进而实现了对多肽的同时鉴定和定量。应用价值：SWATH技术是一种不依赖数据采集的质谱分析技术，质谱仪在不需要考虑信号强度的情况下也可以对复杂的肽段离子进行分选，然后再与数据库中已有的肽段数据进行比对就可以得出特定肽段的信息。因此，此技术可以摆脱免疫方法对抗体的依赖，同时连续运行32个25Da宽的离子分离窗口使得其具有高通量和高灵敏度。

②RNA干扰技术。原理：简单的说是利用一些小的双链RNA（DsRNA）来高效特异性阻断体内特异基因的表达，并促使mRNA降解，从而诱使细胞表现出特定基因表型的缺失。首先dsRNA 经过一种核酸酶III类似的RNA 内切酶 Dicer 作用, 把 dsRNA 链酶切成长约 21到 25nt 的 dsRNA 链，即siRNA, siRNA 和另一些尚未完全确认的蛋白结合形成复合物-RNA 诱导沉默复合物( RNA- inducing silence complex, RISC) 。RISC再识别, 结合与 siRNA 中的反义链互补的 mRNA。RISC 具有核酸酶的功能, 在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂 mRNA 随即降解, 从而使该基因的表达受抑。应用价值：依据RNA 干扰现象, 科学家建立了 RNA 干扰技术, 即人为设计合成针对某特定基因序列的 dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平, 甚至于完全的清除。RNA 干扰技术开辟了基因治疗的新思路。

③基因定点修饰技术中CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术。原理：

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