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实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术 指导教师：张建丽 姓名：高熹 学号：1120152430

测定细菌生长曲线

一．实验目的

1.通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验的基本实验技能。

2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。 3.掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。

二．实验原理

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。

延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。

对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。 稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。

衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。

这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实

验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。

三．实验设备及材料

准备好的大肠杆菌和枯草杆菌菌液、营养肉汤培养基、紫外可见分光光度计、比色皿、恒温摇床、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶、无菌吸管、烧杯、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等。

四．实验方法步骤及注意事项

实验步骤: 配制营养肉汤培养基→营养肉汤培养基灭菌→配制大肠杆菌菌液 标记→接种→培养→测定→绘制生长曲线 1.配制营养肉汤培养基:以1000ml记，牛肉膏:3.0g、蛋白胨:10.0g、NaCl:5.0g、水:1000ml、pH:7.4-7.6

2.营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15min.

3.接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液和1ml的枯草杆菌菌液至锥形瓶中，并充分震荡均匀.

4.培养:将锥形瓶置于37℃下在恒温摇床上培养（150r/min）。然后分别按对应时间将锥形瓶取出，待培养结束时测定OD值。

5.测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光光度计上调节零点，用蒸馏水作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用自来水适当稀释后测定，使其OD值大约在0.2-0.8之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 6.绘制生长曲线:对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果。

五．实验结果

大肠杆菌： 时间0 /min Od 0.6（倍数38 换算） 150 250 310 340 370 400 430 460 490 520 550 0.867 1.566 2.055 2.300 3.100 3.532 3.708 4.008 4.464 5.064 5.229 枯草杆菌： 时间0 150 250 310 340 370 400 430 460 490 520 550 /min Od0.5（倍61 数换算） 0.399 0.353 0.299 0.329 0.558 0.774 0.942 1.264 1.614 1.758 2.214 六．实验结果分析

绘制大肠杆菌生长曲线

绘制枯草杆菌生长曲线

1.随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，大肠杆菌培养瓶味道很难闻，是因为大肠杆菌增长迅速，后来数量达到顶峰，此时培养基内的营养物质已被消耗殆尽，大肠杆菌进行营养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。

2.通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解了细菌生长的特点，是:刚开始时细菌缓慢增长，后来增长迅速，呈“J”型，最后细菌生长缓慢，数量达到顶峰，在一段时间内保持不变。

3.由实验结果来看，两个菌培养菌在对数期，未到衰亡期，考虑到测量的时间太短，10个小时左右，因此，未到衰亡期。

七．思考题

1.绘制大肠杆菌和枯草杆菌在两种接种方法下的生长曲线。 （标出生长曲线中

四个时期的位置和名称）

答：绘制出了生长曲线，只观察到了平缓期和对数期，大肠杆菌观察到即将开始平稳期。

2.为什么用比浊法测定的细菌生长只是表示细菌的相对生长状况？

答：因为比色法只能判断菌的相对密度，而没有办法区分活菌和死菌，因此只能表示细菌的相对生长状况。

3.生长曲线中为什么会出现稳定期和衰退期？在生产实践中怎样缩短延迟期？怎样延长对数期及稳定期？怎样控制衰退期？

答：培养基的营养有限，在菌的数量达到环境允许最大值时，同种菌之间竞争剧烈，故出现稳定期，随着营养的进一步消耗，菌没有足够的营养，出现死亡，所以出现了衰退期。缩短延迟期，可以采用营养成分与原来相近的培养基，或者采用该种菌原来类似的生长条件与营养。延长对数期和稳定期，恒化器可以将微生物保持在对数期进行研究，恒浊器可以使细菌连续生长。控制衰退期可以及时补充营养，分离出死菌。

4.接种时种子在什么条件下为宜，液体种子比斜面种子为什么优越？

答：左手持皿用拇指、食指和中指将皿盖揭开约20-30度左右,角度越小遭空气污染的可能性越小,并靠近酒精灯附近操作。右手持接种环，先在酒精灯灭菌，然后取菌液，将沾菌接种环在培养基的边缘划原始线，而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内。

主要是活化菌种，调整菌种的生理生化状态。液体培养比固体发酵通气效果好，利于大量菌体生长。

八．实验反思

1.应用一台仪器和一个比色皿测量，消除系统误差。 2.在比色皿中加液时，稀释时应该用枪头吹打均匀。