内容发布更新时间 : 2024/6/21 14:12:27星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

试剂盒内容物：

Introduction： Overview：

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：

*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。

*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：

使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：

*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择pFastBac菌体（Vector）：

大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。 Vector pFastBacTM1 特点 高水平表达的强AcMNPV聚乙烯（PH）启动子 用于简单克隆的大量克隆位点 参考 Anderon 1996 pFastBacTMHT 高水平表达的聚乙烯启动子； Polayes 1996 N-末端含有6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用TEV蛋白酶切去； 提供3个阅读框 两个强启动子（PH和p10）Harris和Polaye 1997 pFastBacTMDual

可以同时表达两种蛋白； 两个大的克隆位点 指南用途：

指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、 克隆目的基因到pFastBacTM供体质粒的选择

2、 转化pFastBacTM 结构到最高效的DH10BacTM产生重组质粒 3、 转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒

4、 扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白

重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。

Bac-to-Bac表达系统

表达系统的成分：

表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA

*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBacTM菌株。基于pFastBacTM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7

*第二个主要结构是Ecoli的DH10BacTM品系，用来作为pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacTM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBacTM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBacTM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。 如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。 杆状病毒菌株： 病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的 微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记

*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。

杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）

辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。

图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达

实验轮廓：

流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤

1、 pFastBac donor 质粒（步骤：目的基因的克隆 ） 得到

2、 pFastBac重组体 （转化至DN10Bac细胞（含有杆粒和helper）） 得到 3、 含有重组杆粒的Ecoli细胞 （重新划线） 得到

4、 验证过的含有重组杆粒的Ecoli细胞 （过夜培养，分离重组杆粒DNA） 得到 5、 重组杆粒DNA （使用Cellfectin试剂感染细胞） 得到

6、 P1 重组杆状病毒株（＞106pfu/ml） （感染昆虫细胞扩增病毒） 得到 7、 P2 重组杆状病毒株（＞107pfu/ml） （滴定感染昆虫细胞） 得到 8、 蛋白的表达

培养昆虫细胞：

一般指导：

介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用Sf9和Sf21昆虫细胞作为宿主。在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的Sf9和Sf21，并将其冻存。 使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。我们推荐使用Sf900 Ⅱ SFM。Sf900 Ⅱ SFM对于维持Sf9 和Sf21以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。