内容发布更新时间 : 2024/5/2 7:49:04星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

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基因沉默与RNAi技术

定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

基因沉默是一种RNA干扰技术。

RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex

，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.

一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默

转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活，

它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：

１．基因及其启动子甲基化

甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。

２．同源基因间的反式失活

反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种\沉默子\，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默

后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 ４．重复序列

外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基

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因沉默与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。 ５．位置效应

位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻ＤＮＡ的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。如果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域，转基因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转基因沉默。 （二）转录后水平基因沉默

转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态ｍＲＮＡ存在的

现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。 １．共抑制

共抑制是最常见的转录后水平基因沉默。这一现象首先由Ｎａｐｏｌｉ在转ＣＨＳ基因的矮牵牛花中发现。共抑制现象普遍存在于转基因植物中。共抑制的发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无ｍＲＮＡ积累，是典型的转录后水平基因沉默。若导入的外源基因与内源基因无序列同源性，外源基因自身也常常会发生转录后水平基因沉默。有关研究发现，共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。 ２．基因压制

Ｃｏｇｏｎｉ等在粗糙脉抱霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。Ｃｏｇｏｎｉ等是以类胡萝卜素生物合成基因ａｌｂｉｎｏ－１作为视觉报道基因来研究基因压制的。他们发现，基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态ｍＲＮＡ大量减少。

３．ＲＮＡ干扰ＲＮＡ干扰是１９９８年Ｆｉｒｅ首次在秀丽线虫中发现 并证明属于转录后水平的基因沉默。

利用小片段双链ＲＮＡ可以特异性地降解相应序列的ｍＲＮＡ，从而特异性地阻断相应基因的表达。ＲＮＡ干扰广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。ＲＮＡｉ的作用机制目前尚不完全清楚，学者们在线虫、果蝇、植物和动物卵细胞的ＲＮＡｉ实验中，最近相继发现了一些与ＲＮＡｉ作用相关的酶和蛋白，如ｄｓＲ－ＮＡ特异性核酸内切酶、ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白等。 现已初步阐明ＲＮＡｉ的作用机制如下：各种ｄｓＲＮＡ通过各种转染技术转入细胞内，较长ｄｓＲＮＡ被Ｄｉｃｅｒ的ＲＮＡ酶Ⅲ样特异性核酸内切酶切割产生２１～２３ｎｔ的小干扰

ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ两条单链末端为５＇－磷酸和３′－羟基，且３′端都有２～３个突出的核苷酸。核酸内外切酶、ＡＴＰ、解旋酶与Ａｒｇ－ｏｎａｕｔｅ蛋白相连进而与ｓｉＲＮＡ一起形成具有多个亚单元的ＲＮＡ诱导的沉默复合体ＲＩＳＣ中的解旋酶应用ＡＴＰ解开ｓｉＲＮＡ双链，使其反义链互补结合到靶向的ｍＲＮＡ上与之相匹配的特异性序列，ＲＩＳＣ中的核酸酶降解ｍＲＮＡ，从而使目的基因沉默，产生ＲＮＡｉ现象。ｓｉＲＮＡ也能与ＲＩＳＣ和ｍＲＮＡ联系在一起，在解开ｓｉＲＮＡ的双链后，反义ＲＮＡ链能作为

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双链ＲＮＡ合成的一个引物以ｍＲＮＡ为模板，在ＲＩＳＣ中的ＲｄＲＰ的作用下形成新的ｄｓＲＮＡ，再次被Ｄｉｃｅｒ识别并切断，形成新的ｓｉＲＮＡ再循环，作用于另外的靶向ｍＲＮＡ。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的ｓｉＲＮＡ，使ｓｉＲＮＡ在短时间内迅速并有效地抑制ｍＲＮＡ翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。

ｏｎａｕｔｅ蛋白相连进而与ｓｉＲＮＡ一起形成具有多个亚单元的ＲＮＡ诱导的沉默复合体ＲＩＳＣ中的解旋酶应用ＡＴＰ解开ｓｉＲＮＡ双链，使其反义链互补结合到靶向的ｍＲＮＡ

上与之相匹配的特异性序列，ＲＩＳＣ中的核酸酶降解ｍＲＮＡ，从而使目的基因沉默，产生ＲＮＡｉ现象。ｓｉＲＮＡ也能与ＲＩＳＣ和ｍＲＮＡ联系在一起，在解开ｓｉＲＮＡ的双链后，反义ＲＮＡ链能作为双链ＲＮＡ合成的一个引物以ｍＲＮＡ为模板，在ＲＩＳＣ中的ＲｄＲＰ的作用下形成新的ｄｓＲＮＡ，再次被Ｄｉｃｅｒ识别并切断，形成新的ｓｉＲＮＡ再循环，作用于另外的靶向ｍＲＮＡ。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的ｓｉＲＮＡ，使ｓｉＲＮＡ在短时间内迅速并有效地抑制ｍＲＮＡ翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。 二、基因沉默的相关实验技术及其进展

目前在基因沉默中主要是ＲＮＡ干扰的实验技术应用较多，根据靶ｄｓＲＮＡ合成的方法可将ＲＮＡｉ技术分为３种。 １．体外化学合成法

最为经典的方法，共分４个步骤： （１）化学合成ｄｓＲＮＡ；（２）将ｄｓＲＮＡ导入宿主细胞；（３）检测靶基因抑制效率；（４）功能研究。其中，ｄｓＲＮＡ合成成本很高，ｄｓＲＮＡ转入宿主细胞效率及其在宿主细胞中的稳定性均不确定。 ２．体外转录法

这种方法采用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，以先合成的ＤＮＡ链为模板反转录合成ｄｓＲＮＡ，从而使合成ｄｂＲＮＡ的成本大大降低，但这种方法与化学合成法有相同的缺点。 ３．体内载体合成法

这是近年来迅速发展起来，克服了前两种方法缺点的新技术。它是２００２年Ｐａｄｄｉｓｏｎ等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达ｓｉＲＮＡ，从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法。

其基本思路如下：细胞内存在ＲＮＡｐｌｙｍｅｒａｓｅⅢ，它可以识别Ｕ６启动子，从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。当模板连续出现３～５个\Ｔ\

碱基时，转录就会终止。根据这一机制，可以设计一种能表达ＲＮＡ的质粒，其组成包括４部分：（１）常用质粒的基本序列；（２）Ｕ６启动子，位于克隆位点的上游；（３）克隆位点；（４）ＲＮＡｉ模板序列（ＤＮＡ）。这部分序列具有如下特点：含ＲＮＡｉ序列，对哺乳动物而言，通常为２１～２３个核苷酸；发夹结构环状部分，通常有４～７个核苷酸；靶序列的反向互补序列；３～５个核 苷酸\Ｔ\。将具有如上结构的质粒导入细胞内，体内的ＲＮＡｐｌｙｍｅｒａｓｅⅢ就可以合成一条ＲＮＡ链，这条ＲＮＡ链可以通过两端的２１个左右的核苷酸反向互补特性而形成发夹样双链结构，从而起到基因抑制作用。这种技术操作简便，成本低，与直接导入ｓｉＲＮＡ相比，ＤＮＡ质粒更易导入细胞内，

而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究，因而成为一种热门技术。近年来多位作者几乎同时报道了利用上述载体技

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