土壤酶实验步骤. 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/6/16 22:22:47星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

土壤酶的测定

1. 三角瓶用稀HNO3(3-5%)或用洗衣粉浸泡24h,后刷洗,然后再用蒸馏水润洗,晾干。

2. 土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ,重复一次,14.5×2=29g。

一、过氧化氢酶(容量法)(关松荫P323) 1.试剂配制:

(1)0.3%过氧化氢溶液:

①(1:100 30%的H2O2和水) ②(0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水)

③(1ml30% H2O2+99ml蒸馏水) (2)3N硫酸:(10ml硫酸+50ml水)

(3)0.1N高锰酸钾溶液 :(1.58gKMnO4+100ml蒸馏水) 2.操作步骤:

2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢(现配)→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸(以稳定未分解的H2O2)→用慢速型滤纸过滤,→吸取25ml滤液,用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3.结果计算

过氧化氢酶的活性(M),以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示: M=(A-B)×T 式中:

A:空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数 B:滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数 T:KMnO4滴定度的校正值 备注:

以容量法测H2O2的酶活:Kappen(1913)首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H2O2与土壤相互作用时,未分解的H2O2的数量用容量法(常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2)测定H2O2的酶活 2 KMnO4+5H2O2+3H2SO4→2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2 土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用 二、蔗糖酶(P278)滴定法 1.试剂配制:

(1)20%蔗糖:(20g蔗糖+80ml水或12.5g蔗糖+50ml水) (2)甲苯(分析纯)

(3)PH5.5醋酸盐-磷酸盐缓冲液

0.5ml磷酸氢二钠·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氢钾(1/15M) 磷酸氢二钠·12H2O(1/15M) :23.88g Na2HPO4,,加H2O溶解,定容至100ml。 磷酸二氢钾(1/15M):9.072g KH2PO4,加H2O溶解,定容至1000ml。 (4)33%KI溶液(4.925g+10ml水)现配,冰箱遮光

(5) H2SO4(1:3)(体积比):15ml 98%H2SO4 + 45ml蒸馏水 (6)淀粉指示剂

取0.5g淀粉溶于少许水中,加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。 (2.5%NaCl:2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。) (7)0.1NNaS2O3 滴定液

取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中,加入少量的碳酸钠,稀释至1升。 (8)菲林溶液

取3.464克CuSO4· 5H2O溶于蒸馏水,并稀释至50ml(a),取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水,并稀释至50ml(b),使用前将(a)(b)按1:1混合。

2.操作步骤

取2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。加2.5ml 20%蔗糖和 2.5mlPH5.5醋酸铅-磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。 培养结束后,加12.5ml蒸馏水。

摇荡后过滤,取5ml的滤液移入100ml三角瓶中,加2.5ml的菲林溶液,在沸水浴上放置10min,冷却至室温后,再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4(1:3)。加入淀粉指示剂2滴,然后用0.1NNaS2O3 滴定。 颜色:棕色→棕蓝色→乳白色(滴定结束)

注意:减量滴定,一般取5ml即可,滴定需NaS2O3溶液(大量) 空白对照:30.15ml(取5ml时) 3. 结果计算:

蔗糖酶活性(M),用对照与试验的0.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。 M=(A-B)×T×17.875/5/2.5 式中:

A:对照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升数 B:滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数 T:NaS2O3 滴定度的校正值

×17.875/5/2.5:换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量 三、脲酶 1.试剂配制

(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液

取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中,另取2.95g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将PH调至6.7,并将水稀释至20ml 。 (2)苯酚钠溶液

称62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2ml甲醇和18.5ml丙酮,然后用乙醇稀释至100ml(A液),存于冰箱中。

称27gNaOH溶于100ml水中(B液),存于冰箱中。

使用前,取A,B两液各20ml混合,并用蒸馏水稀释至100ml备用。 (3)次氯酸钠溶液

用水稀释制剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。

(17.3mlNaClO定容至100ml)。 (4)10%尿素液 10g尿素+90ml水 50g尿素+450ml水 (5)甲苯

(6)氮的标准溶液(不要配)

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制氮的标准曲线时,可将此液稀释10倍供用。 2.操作步骤

取5g风干土,至于50ml三角瓶中,加1ml甲苯。15min加10ml 10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中,然后加蒸馏水20ml,再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,边加边摇匀。

20min后显色,定容50ml:1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然后按绘制标准曲线(显色方法)进行比色测定。 3.结果计算:

脲酶活性(M)以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示 M=x×31/3/5

标准曲线:y=0.0268x+0.001804 即:M=(0.001804-y)×31/3/5/0.0268 式中:

x:从标准曲线查得的NH3-N毫克数 y:578nm处吸光度 ×31/3/5:换算成1g土的系数 四、磷酸酶