内容发布更新时间 : 2025/1/6 16:10:37星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）
GK4003-10 GK4003-20 GK4003-50 GK4003-100
一.试剂盒组成
Components GenClean Column 2.0-ml Collection Tube
Lysis Solution AW1 Solution(a) AW2 Solution(b) AE Buffer(c) TE(pH8.0) Boiled RNase A Proteinase K(d) Lysozyme(f) SP Buffer protocol
GK4003-10 10 Preps 10 10 4 ml 6 ml 3 ml 3 ml 2 ml 50 μl 30 μl 5 mg 1.0 ml 1
GK4003-20 20 Preps 20 20 10 ml 12 ml 8 ml 8 ml 4 ml 240 μl 250 μl 15 mg 1.0 ml 1
GK4003-50 50 Preps 50 50 25 ml 30 ml 20 ml 20 ml 10 ml 480 μl 500 μl 30 mg 1.0 ml 1
GK4003-100 100 Preps 100 100 50 ml 60 ml 40 ml 40 ml 20 ml 120 μl 1000 μl 60 mg 1.0 ml 1
(a) 首次使用前，必须在AW1溶液瓶中按表示量加入无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖
紧，以保持中的AW1乙醇含量。如果您发现AW1由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入0.6倍体积的无水乙醇。
(b) 首次使用前，必须在AW2瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，
以保持AW2中的乙醇含量。如果您发现AW2由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。
(d) AE Buffer为10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA pH 8.5。TE(pH 8.0)或者水（pH>7.0）均可以使用，但是DNA的洗脱效率通常要低20%左右。
(e) 收到后分装-20℃冻存。不得将Proteinase K直接加到Lysis Solution中，以免酶失活。 (f) Lysozyme使用前加入按5 mg溶于100μl计算，溶于SP Buffer，溶解后，分装于-20℃冻存。 客户自备：PBS缓冲液，胰蛋白酶，无水乙醇
运输 储存温度 运输 室温
储存 Proteinase K , Lysozyme , Boiled RNase A : -20℃ 其他 室温
二．主要用途
从细菌和各种培养细胞中小规模抽提基因组DNA。
三．主要特点
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在50分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保提取细菌基因组的高纯度，OD260/280nm典型的比值达1.7～1.9，长度可达50～100kb，可直接用于PCR， Southern-blot和各种酶切反应。
四．培养细胞与细菌样品准备
1．培养细胞的准备
(1) 对于悬浮培养细胞： 1,000g室温离心5分钟，彻底去除上清。
(2) 对于单层培养细胞：吸去培养基，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。当细胞从培养瓶表面
脱落以后，将细胞转移到离心管中，1,000g室温离心5分钟，彻底去上清。 (3) 将离心去上清的细胞用200μl TE(pH8.0)悬浮。
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处理细胞可达1×10～5×10个，增加处理细胞数量，请相应增加处理时间。 2．细菌样品的准备
(1) 将适量的指数生长期细菌（最多可达5×108细菌，约0.5 ml过夜培养菌液），8,000rpm，离心1分钟，
彻底弃净培养基。 (2) 加入200μl TE(pH8.0)悬浮细菌，按照下表中的要求加入Lysozyme溶液，用吸头混匀，对于革兰氏阳性
和革兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。
革兰氏阴、阳性菌所用溶菌酶浓度与酶解时间表 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 溶菌酶终浓度 400μg/ml 3mg/ml 加入Lysozyme体积 1μl或不加 ~8μl /200μl悬液 室温下酶解时间 3～5分钟 5～10分钟 五．操作步骤 1. 在按准备方法制备的200μl TE悬浮样品中，加入4μl RNase A混匀，再加入4μl Proteinase K，加入
200μl Lysis Solution 70℃保温10分钟。
注意：(1)应按次序加入，不得将Proteinase K先加入Lysis Solution再加到样品中。
2. 冷却到室温，加入200微升无水乙醇，混匀。如有沉淀出现，用1 ml枪头充分打匀,不影响提取。 3. 8,000rpm室温离心1分钟。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。 4. 将GenClean柱放回收集管中，加入500μl AW1 Solution，8,000rpm，室温离心1分钟。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。
5. 将GenClean柱放回收集管中，加入500μl AW2 Solution，8,000rpm，室温离心1分钟。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。 6. 重复步骤5一次。
7. 将GenClean柱放回收集管中，12,000rpm，室温离心1分钟，以去除残留的AW2 Solution。
注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。
7. 将GenClean柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，在GenClean柱中央加入50～100μl AE Buffer，室温或37℃放置2分钟。
注意：(1)为提高洗脱效率，可以将AE Buffer不能低于27℃，或预热到55～80℃。
(2) 如果样品中基因组DNA含量很低，用30μl AE Buffer洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。
8. 12,000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。 注：重复步骤7～8，将洗脱液再次加入到吸附膜上，重新洗一次，可以提高产率10%～20%。 9. 用分光光度计测量DNA含量按1OD260=50μg/ml基因组DNA定量并标记。进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判
定样品DNA的完整性和是否有RNA。本试剂盒抽提的DNA长度可达100kb以上。
六．储存
常温储存一年。
七．问答
Q-1 基因组DNA得率低或无基因组DNA
A-1一般情况下，从100μl-1ml过夜培养的大肠杆菌中，可以提取1-10μg的基因组DNA，推荐的菌液量是用500μl的过夜培养的浓菌液。我们不建议用过多的菌液，可能导致溶液不足而降低所提DNA的质量。基因组DNA得率较低时可从一下几个方面考虑：
1.DNA未充分释放，保证在TE中充分悬浮菌体，注意不要残留菌体，加入Digestion Solution充分混匀。 2.溶菌酶失活，溶菌酶要用附带的SP buffer配制，用水或碱性的TE配置的溶菌酶不能长期保存。配制好的溶菌酶最好分装成小份于-20℃保存。
3.Proteinase K失活，proteinase K起到酶解细菌的作用，该酶失活后细菌裂解效率将大大降低。
4.洗脱时将灭菌水或Elution Buffer 加热至65℃后使用将有利于提高洗脱效率。 5.严格按照操作方法进行操作有利于提高基因组DNA得率。
Q-2提取的基因组DNA有降解，为什么？
A-2 1.确认选用的培养菌体是否新鲜，如果菌体需要保存时，请于-80℃保存 2.起始菌液量过多，导致菌液裂解不充分，部分DNA降解。
3.菌体本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再补加20ul 0.5M EDTA溶液来抑制内源性核酸酶。
Q-3 提取的DNA中有RNA污染，为什么？
A-3 1.一般提取基因组DNA过程中，RNA残留已经很少了，如果需要减少提取DNA中的RNA的含量，有必
要在消化步骤中加入4μl RNase A。
2. RNase A可能失活。RNase A一般比较稳定，不易失活。如果确认是RNase A长期保存等原因导致其活性
丧失，可以用实验室中已有的RNase A替代试剂盒中的RNase A。
Q-4 提取的基因组DNA生物活性差，为什么？
A-4 1. 提取的基因组DNA中盐分浓度过高，请严格按照说明书操作。
2. 提取的基因组DNA中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。
Q-5 能否用本试剂盒提取酵母中的基因组DNA？
A-5 不能，酵母属于真核生物，其细胞壁的化学组成和结构与细菌不同，因此Lysozyme不能使其细胞壁溶解，
所以，本试剂盒不能提取酵母中的基因组DNA。如果需要提取酵母基因组DNA，请用酵母提取试剂盒。
Q-6 本试剂盒是否适用于任何菌体基因组DNA的提取？
A-6 不一定。有些细菌的细胞壁的结构比较特殊，使用Lysozyme进行溶菌，其基因组DNA不能有效的释放出来。比如Staphylococcus Aureus 等革兰氏阳性菌便无法使用本试剂盒提取基因组DNA。
Product Use Limitation:
This product is developed, designed and sold exclusively for research purpose and in vitro use only.