内容发布更新时间 : 2024/5/5 14:25:26星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

小麦不同部位蛋白全程研究过程简介

1.1小麦叶片蛋白质组提取

采用TCA／丙酮沉淀一酚／SDS联合抽提法来提取小麦叶片蛋白。参照Wang等 [1]方法，加以改进。取新鲜的小麦叶片1g，液氮中迅速研磨成细粉，加入10mI于一20℃预冷的提取介质[10 TCA(w／V)丙酮溶液+0．2 DTT]，反复颠倒混合，一20℃ 沉淀2 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心10 min，弃上清；沉淀用含100mmol／I 醋酸铵的80 甲醇溶液洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内室温干燥10 min；加入10mI 酚／SDS抽提夜[-pH 8．0 Tris饱和酚与SDS缓冲液(30 蔗糖、2 SDS、5 J3一巯基乙醇、0．1mol／[ pH 8．0 Tris—Hc1)1：1}昆合]振荡混匀温育5 min，4℃ ，16 000×g离心10 min，转移上层酚相至一干净新管中，加入5倍体积的冷的含100mmol／I 醋酸铵的甲醇溶液，一20℃ 沉淀4 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心lOmin，弃上清液，沉淀用甲醇洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内自然风干，～ 80℃ 冰箱保存备用。 1.2 小麦胚乳蛋白的提取 赵[2]选用TCA-丙酮法，抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后10 d取挂牌标记的5个穗，取穗中上部灌浆一致的籽粒，剥去颖壳置于冻存管中-80 ℃保存。取冻存籽粒20粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵中迅速剥去种皮，切去胚，加0.2% PVP迅速研磨至糊状，悬浮于含0.07% DTT的预冷10%TCA-丙酮，-20 ℃过夜。次日4 ℃ 35 000 r·min-1离心15 min， 弃上清， 将沉淀重悬于80%丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃ 16 000 r·min-1离心15 min。沉淀重悬于100% 丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃16 000 r·min-1离心15 min。重复此步骤2~4次，倒出上清液，离心管置于冰浴中抽真空15 min至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。 1. 双向电泳技术

1.1 小麦叶片蛋白质组双向电泳技术

参照李[3]采用SDS—PAGE和双向凝胶电泳30 mg蛋白粉加入300 FI 水化上样缓冲液(8mol／I 尿素、4 CHAPS、65 mmol／I DTT、0．2V／V BioIyte)，37℃水浴30 min，6℃ ，40 000×g离心30 rain，取上清液，Bradford法测定蛋白浓度 。SDS—PAGE电泳上样量为100 mg，蛋白样品与2×电泳上样缓冲液等体积混合，直接在12 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，胶体考染口 ，用普通凝胶成像系统(Bio—Rad，美国)采集图像。双向电泳采用BioRad公司电泳系统(Protean IEF cell等电聚焦系统、PR()TEAN 11 xi Cell垂直电泳系统、Mini pro—teanⅢ cell垂直电泳系统)，蛋白上样量为：7 cm胶条200 Fg、17 cm胶条5OO Fg。等电聚焦和向第二向SDS—PAGE的转移参照Bio—Rad操作指南进行。IPG胶条为7、17 cm(pH值3～10、4～7，Bio—Rad)，第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为12 。染色采用胶体考马斯亮蓝染色方法l1 。UMAX Power—I．ook 2100XI 型光密度扫描仪(Bio—Rad，美国)，分辨率设为300dpi采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行3次重复。PDQuest 7．4软件(BioRad，美国)对图像进行分析。 2.2 小麦胚乳蛋白的双向电泳 对小麦胚乳采用以下技术进行电泳如赵[4]. 样品被动上样及等电聚焦, 选用17 cm IPG胶条（pH 4~7）。IPG干胶条胶面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝水，被动水化14 h 后，置于Bio-Rad 等电聚焦仪中，等电聚焦在20 ℃条件下自动进行，每胶条限流50 μA。等电聚焦参数如下：① 500 V 4 h 除盐；② 1 000 V 1 h 线性上升（Gra）；③ 8 000 V 2.5 h 线性上升（Gra）；④ 8 000 V 0.5 h 聚焦。胶条的平衡, 将等电聚胶后的胶条胶面向上置于5 mL平衡缓冲液Ⅰ（50 mol·L-1 Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea， 30%甘油， 2% SDS， 0.002% 溴酚蓝， 1%DTT）中平衡摇床震荡15 min，然后再置于5 mL平衡缓冲液Ⅱ（50 mmol·L-1 Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-urea，30%甘油，2% SDS，0.002% 溴酚蓝，2.5%碘乙酰胺）中平衡15 min，取出后放在湿润的定性滤纸上，以吸去表面多余的液体。SDS-PAGE, 采用Bio-Rad 垂直电泳系统， 胶的浓度为12%，

将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面上，用0.5%的低熔点琼脂糖封顶液封闭排除气泡。在电泳槽中加入约1.5 L 电泳缓冲液（0.025 mol·L-1 Tris，0.192 mol·L-1 Glyeine，0.1%SDS）第一步每块胶10 mA下电泳30 min，第二步每块胶20 mA下电泳至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0.5 cm时停止电泳。考马斯亮蓝染色, 电泳后将凝胶立即放入固定液（40%甲醇，l0%乙酸）中至少30 min，可过夜；充分固定后用Millipore纯净水洗2次，每次5 min；换置考马斯亮蓝染液（10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，0.06%考马斯亮蓝G250染色，至少2 h；用脱色液（25%乙醇，8%乙酸）脱去底色，或者直接用Millipore纯净水脱色，直到蛋白点清晰为止。

3 . 蛋白质鉴定

3.1 小麦叶片蛋白质鉴定采用以下技术。蛋白质组分通过双相电泳等分离技术分离后，必须通过适当技术鉴定，才能知道蛋白质组成分的性质、结构和功能及其各蛋白质间的相互作用关系，从而最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究。 3.1.1 以质谱为基础的分离鉴定技术

3.1.1 .1同位素亲和标签技术（isotope-coded-affinitytag, ICAT）ICAT 技术是质谱用于差异蛋白质组的典型技术，最早是由Gygi 等发展运用起来的。ICAT 技术的关键是其同位素标记的带有生物素的巯基烷化试剂，其结构主要由三部分构成:(1)亲和标签(一种生物素，biotin)，用来分离ICAT 标记多肽的基团；(2)连接子，用来整合稳定的同位素，可以引入8 个氢原子或8 个氘原子；(3)活性基团，专一的化学反应基团(与蛋白质的Cys 的一SH专一反应)。根据引入8 个氢原子或8 个氘原子的不同，ICAT 试剂分为轻型和重型两种。两者分子量相差8u。当对两种蛋白样品比较分析时，用ICAT 标记样品, 将两个样品混合、酶解后, 通过生物素的亲和层析将标记的肽段分离出来,对生物素ICAT 标记的酶解片断进行在线HPLC-MS/MS 分析，经二级MS/MS 鉴定出该肽段属于何种蛋白后, 由峰的相对强度对该蛋白在不同样品中的含量进行相对定量而找出两种样品中同一种蛋白质表达的差异。该方法具有许多优点，它可直接对混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 进行分析；另外，通过只分离含有半胱氨酸的肽混合物，使其分析的复杂性大大降低；对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白；还可快速找出重要功能蛋白质如疾病相关蛋白质及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断。Brand 等应用该技术研究小鼠红细胞分化过程中转录因子F-E2P18/MafK 的表达变化情况，结果表明ICAT 技术具有灵敏的鉴别能力[4]。Gygi 和Rist 等采用ICAT结合2D 色谱—质谱的方法, 对含有半胱氨酸的低丰度蛋白进行了准确的定量与鉴定[5]。但ICAT 在定量及差异表达检测上也存在一些缺陷。如无法检测不含半胱氨酸的蛋白质；其次，半胱氨酸残基必须位于易处理的位置上，否则没有足够的氨基酸提供必须的鉴定信息；ICAT 标记的分子(分子量约500Da)相当大的修饰使数据库搜索的算法复杂化；另外则与氧化容易混淆，所以应用范围有一定的局限。目前，Aebersold 及其同事发展了一种固相同位素标签技术，与传统ICAT 技术相比，优点在于：含有半胱氨酸肽段的分离和蛋白质的标记在一步内完成，减少了实验步骤；肽段以共价键与固相物体表面结合，能够经受强烈的洗脱条件以除去非共价结合的肽段；实验不受蛋白质裂解酶、强去垢剂以及尿素等的影响，标签的质量较小和呈中性，观察到的肽段不易被忽略。

3.1.1 .1 蛋白质芯片质谱技术蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料，能同时从微量的样品中检测大量的蛋白质或多肽，是一个快捷、高效、并行、高通量的蛋白质分析技术。目前常将蛋白质芯片和表面增强的激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)相结合来研究差异表达蛋白质。其原理是将从细胞或体液中提取出的蛋白质混合物与一系列不同性质的蛋白质芯片相结合,洗去未结合的蛋白质,然后用质谱读出与芯片结合的蛋白质, 就得到了基于不同相互作用的多维蛋白质图谱,比较不同样本的质谱图,寻找差异蛋白。这种蛋白质芯片质谱技术最本质的优点是通过表面选择性吸附大大降低了蛋白质的复杂性，又能对多样品平行分析，从而

把每个蛋白放在一个具有相互参照价值的背景里。同时它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等。另外，各种芯片所收集的蛋白具有不同的等电点、金属结合能力以及疏水特性，这使研究者在分子质量之外得到了额外的信息，通过使用高通量的MALDI-TOF 检测，能够快速可靠地识别蛋白质，因此在差异蛋白质组的研究中获得较多青睐。Petricoin 等用蛋白质芯片技术从卵巢癌病人的血清中筛选出了5 个标志蛋白，对临床样品的检测灵敏度达100%[6]。Brynmor 等采用SELDI -TOF 技术在乳腺癌患者的血清中发现了NMP66 , 为公认的乳癌诊断标记物。但是蛋白质芯片技术在应用于寻找差异表达蛋白质时也具有局限性, 如待检测的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来。

3.1.2 蛋白质和多肽的N 端、C 端氨基酸序列分析在蛋白质鉴定方面,质谱技术已基本取代传统的dman 降解法，但依托Edman 降解法的N 端氨基酸序列分析技术仍发挥着重要作用。它利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该方法精确性高,但测序速度较慢,且费用偏高,仅适用于分析少量差异表达蛋白质位点。 3.2 小麦胚乳蛋白的鉴定

3.2.1 De novo 测序和数据库搜索相结合

De novo 测序是一种直接解释串联质谱数据的方法. 每个串联质谱峰对应一对肽键的裂解，通过确定质谱中峰的离子类型可以得到这个峰对应肽段的前缀或后缀子序列的质量. 理论上，可以根据串联质谱中信号强度高的碎片离子之间的质量差和母离子信号确定离子类型，得到相应的b 离子、y 离子或其他离子峰. 然后通过计算相邻的同类型碎片离子之间的质量差获得肽段的全长序列[5].De novo 测序通过串联谱中的信息重建肽段序列，不受已知蛋白质或基因组数据库所包含信息的影响，在下面几个情况下体现了它在鉴定新蛋白质领域中的灵活性：a. 基因组测序不完全而使得数据库中未包含待鉴定的蛋白质序列；b. 基因测序和预测软件中的错误，导致预测的蛋白质数据库中没有对应序列或对应蛋白质序列不正确；c. 基因的可变剪接体翻译得到的新蛋白质序列、编码区单核苷酸多态性引起的不同蛋白质变体，以及含修饰信息的序列等，这样的序列在数据库中都没有对应条目.在上述情况下数据库搜索方法往往无能为力，而de novo 测序则提供了一种可能的方法. 实际应用中de novo 测序的通量极低，并且得到的肽段序列仍需通过序列比对找到与其功能或序列同源的蛋白质才有意义. 一般的谱图通过de novo测序只能得到少数可靠性较高的短片段，与后续其他手段结合才能达到鉴定蛋白质的目的. 因此，常将de novo 测序和序列比对相结合来鉴定新蛋白质.按照产生短序列标签方法的不同具体分2 种：a. 应用同位素标记得到序列标签.在样品预处理过程中加入诸如13C、18O 和15N等同位素标记，例如分离后的蛋白质在含有18O 环境中用胰岛素酶酶解，18O 原子会选择性标记C 端羟基集团[6]. 随后经MS/MS 碎裂，通过手工或软件解读串联谱图，根据谱图上特定离子固定质量单位的偏移读出对应序列，组装成肽段序列标签再进行下一步的数据库搜索.Matis 等[7]研究某菌类的蛋白质组时，该物种的基因组尚未测序. 将样品在16O 和18O 含量为1∶1 的水中酶解进行同位素标记，分别经2 种不同的ESI-QTOF (QTOF： quadrupole time-of-flight massspectrometer，四极杆- 飞行时间串联质谱仪)质谱仪测序，按照18O 标记的规则手工解读谱图得到有同位素标记的肽序列标签，分别使用序列比对软件MPsrch、FASTS 和WU-BLAST2 对数据库做同源性搜索，3 种软件都鉴定了4 种新蛋白质，并通过功能研究和序列同源性分析最后确定了一个可以解释其脱氢酶活性的新蛋白.b. 由de novo 测序软件得到序列标签不依赖于实验的处理过程，应用de novo 测序软件直接从常规的串联质谱图中读取肽段序列. 常见de novo 测序软件的典型输出结果是一系列有序、无序的短肽段序列标签，或残基质量标签，利用这些短片段也就组成了序列标签.常用产生肽序列标签的软件见表1. 一般的denovo 测序软件都可以通过网页形式免费访问，能满足大部分实验鉴定的需要，如果需要本地化大批量的对质谱数据进行肽序列标签

的读取可以购买商业版本的软件如Peaks，或者下载免费的代码如Pepnovo 等. 由de novo 测序软件得到的短序列标签将通过数据库搜索算法与理论序列相关联，找到一致或相似的蛋白质序列. BLAST、FASTA、Shotgun[8]是序列同源性搜索最基本的几种算法，最初运用denovo 测序得到的短肽标签进行下一步蛋白质鉴定分析的软件大多是基于它们的改进像MS-BLAST、FASTS/FASTF 和MS-Shotgun，一般都没有考虑de novo 测序的错误. 随后基于FASTA算法改良的CIDentify 考虑了同位素峰和氨基酸质量无法区分的情况. DeNovoID 这个算法依赖于氨基酸序列的组成而对顺序没有要求，所以其用于查询的标签既可以有序也可以无序，还可以包括质量标签. 同源性搜索工具SPIDER 考虑了同源突变和de novo 测序的错误. GutenTag 软件整合了肽序列标签的产生和同源性比较搜库2 分，但没有考虑序列的同源突变和修饰. 主要序列同源性比较软件关于这类方法的应用，早在1994 年，Mann和Wilm[9]就提出了用肽段序列标签鉴定蛋白质的方法. 他们将(碎片质量m1 - 部分序列- 碎片质量m2) 这种形式的肽段序列标签提交给软件PeptideSearch，既可以鉴定数据库中包含的蛋白质，还能鉴定数据库中没有的带有修饰的蛋白质或者可能的新蛋白质. Kim 等[10]在研究一种基因组未测序的土壤细菌时，从Mascot 搜索细菌nr 库没有匹配结果的MS/MS 谱图中手工挑取质量较好的，使用PepSeq 得到部分肽序列，通过与Mascot 结果比较，再经BLAST 同源性搜索得到高可信度的鉴定蛋白质以及一些新蛋白质. Lilla 等[11]也是运用denovo 测序软件PepSeq 和同源性比较程序last-p 鉴定了一个新蛋白质. Kim 等[12]对他们研究中PMF 和PFF 搜索库不能鉴定的结果应用Masslynx 软件经de novo 测序得到部分肽段序列，然后通过NCBI上的Blast 和MS-BLAST 搜索得到接近全长的较精确的匹配结果. Williams 等[13]同样也应用PepSeq 得到序列标签，然后通过MS-Pattern 搜索NCBI 的nr库鉴定蛋白质. 3.2.2 分步、多策略的数据库搜索: 采用ESTs、基因组数据库

De novo 测序不能取代数据库搜索方法在自动化- 高通量蛋白质组学研究中的应用，同样在大规模蛋白质组学研究中进行新蛋白质的鉴定，数据库搜索方法也是不可缺少的. 但因为该方法强烈地依赖于数据库中所包含的蛋白质序列，即使质量很好的谱图，如果数据库中不存在相应的条目也无法得到鉴定结果. 因此，常规的蛋白质数据库不能实现鉴定新蛋白质的目的. 同时，数据库搜索的方法也不能发现序列信息未知的蛋白质，即无法鉴定层次最高的新蛋白质，但是通过分步、多策略的数据库搜索，如采用ESTs、基因组数据库等更广泛全面的数据库，可以鉴定前2 个层次的新蛋白质.大部分蛋白质组学研究在进行基本的蛋白质鉴定的同时也利用实验质谱数据进行补充鉴定和新蛋白质挖掘[14]. 其主要策略就是我们这里提到的分步、多策略的数据库搜索. 早在2001 年，Andersen等就应用二级质谱数据搜索基因组数据库，结合一级谱图分析完善鉴定结果. 这样不但对蛋白质鉴定起到一定的补充作用，并能校正软件预测的基因组ORFs，还能鉴定新蛋白质，文中就用该策略鉴定了一个人的新蛋白质. 2001 年，Creasy 等提出了高通量并且有效的蛋白质鉴定，实验数据应该搜索一系列逐渐增大的数据库：首先，是一个小而质量高的蛋白质数据库如Swiss-Prot 数据库，没有匹配结果的数据再搜索一个全面的EST 数据库，搜索基因组数据库是最后一步. Smith 等在2005 年根据纤毛虫的核酸遗传编码规则，直接将嗜热四膜虫的基因组序列分别按6 个相位翻译成对应的氨基酸序列作为Mascot 搜索的数据库，鉴定了223 个高可信度的蛋白质，然后将鉴定结果与NCBI 的nr数据库进行BLAST 同源性比对，确定了84 个nr库中没有相似蛋白质的结果，认为可能是新蛋白质. 到2006 年，Nesvizhskii 等使用了多种搜索库软件如SEQUEST、Mascot 及X!Tandem，以及不同的参数设置如改变质量误差范围、增加修饰等，以得到尽量多的鉴定结果，并进一步对质谱图按照质量分等级，在基本搜索库没有结果的谱图中挑取质量较好的再搜索基因组数据库进行新蛋白质挖掘. Ying 等也将分步搜索策略应用于人类胎肝蛋白质组学研究的补充鉴定和新蛋白质挖掘中，在进行基本蛋白质鉴定的基础上，应用Q-TOF 数据先后搜索了整合的蛋白质数据库、人类EST 数据库和基因组数据，找到

了更多的蛋白质包括一些新蛋白质. 在数据库搜索策略中采用基因组数据解释质谱数据，并进一步将鉴定结果与基因组综合比较，可以直观地进行转录组和蛋白质组的比较，并实现蛋白质组研究对基因组的补充. Desiere 等[15]利用Ensembl 的分布式注释系统(Distributed AnnotationSystem：DAS)，将SEQUEST 搜库鉴定得到的肽段用BLAST 对应到人类基因组上，并实现可视化.Kalume 等利用质谱数据经Mascot 搜nr 和基因组数据库，再利用DAS 实现可视化把鉴定的肽段匹配回基因组上，并通过实验蛋白质组学的鉴定结果与基因组TBLASTN 比对，确定已知的转录本、新转录本以及一个新基因，并且校正了一些已知转录本. HPPP 在人类血浆蛋白表达谱研究中也对血浆数据进行了新蛋白质鉴定的数据挖掘，他们把人类全基因组按6 种相位开放阅读框翻译成无遗漏的蛋白质数据库作为X!Tandem 软件搜索的数据库，来鉴定血浆蛋白的串联质谱数据，并采用层层严格的质量控制标准来降低假阳性率，将质谱结果匹配到基因组序列中发现了新基因模式，以及可能的新基因编码区和新可变剪接体.综上所述，应用完整的、未经注释的基因组序列来进行蛋白质的鉴定可以极大程度地挖掘质谱数据. 合理安排分步、多策略的数据库搜索，并使用合适的搜索引擎和数据库，可以实现批量、自动化的新蛋白质鉴定，是目前高通量蛋白质组学研究中补充鉴定新蛋白质很好的一种选择.

4. 蛋白质蛋白质相互作用

4.1 蛋白质-蛋白质相互作用的特点生物体内有大量的蛋白质复合物，它们有的由相同的蛋白亚单元组成，有的由不同的蛋白亚单元组成，有些呈永久性结合状态，有些会根据周围环境(如温度、pH 值等)的变化而进行结合和解离。蛋白质复合物虽然在数量上远远超过酶和小分子受体，但它们本身的一些性质和特点却使得很多蛋白质复合物并不适合作为药物的靶标。因此，我们首先需要很好地了解蛋白与蛋白之间的相互作用，这样才能够找到适合与抑制剂结合的蛋白质-蛋白质相互作用界面，进而以其为靶，进行药物研发。1.1 界面的大小 蛋白质与蛋白质结合的界面通常较大。Jones 和Thornton通过对59 个不同的蛋白质复合物进行研究分析发现，同源二聚体相互作用的可溶剂化表面为368?2 － 4 746?2，异源复合物的可溶剂化表面为639?2 － 3 228?2。Lo Conte 等也提出蛋白质相互作用的平均界面约为1600?2，包括大约52 个氨基酸残基。理论上，大的结合表面不适合作为药物靶标，这是因为很难找到与之相匹配的分子，即使存在这样的分子，它也会由于吸收、分布、代谢、排泄、毒性(Absorption、Distribution、Metabolism、ExcretionExcretion 、Toxicity，即ADME/T)的性质而被排除在药物的行列之外。然而，“热点区域”(hot spots)[8] 概念的出现却打破了这种观点。热点区域是指对蛋白质复合物的结合自由能贡献比较大的残基。它的面积大约只有600?2，一般位于蛋白质-蛋白质相互作用界面的中心或其附近， 通常为Trp、Tyr和Arg。Sillerud和Larson[9]运用统计学方法研究比较了蛋白质-蛋白质相互作用界面中残基对其结合自由能的贡献，发现Pro、Ile、Tyr、Trp、Asp 和Arg 对蛋白的结合贡献较大。这一结论与热点区域较为吻合。热点区域的常用表征方法为点突变实验，即将蛋白质-蛋白质相互作用界面上的氨基酸残基突变为丙氨酸，然后，测定其结合自由能的变化，以此来确定对结合自由能贡献比较大的残基。然而，实验的方法耗费的时间和费用通常较大，因此，选用计算的方法来测定热点区域深受人们的青睐。目前，较为流行的计算方法有MM-PBSA (molecularmechanics-Poisson-Boltzmann surface area)中的“基于计算的丙氨酸扫描(computational alanine scanning)”和MM-GBSA (molecular hanics-generalizedBorn surface area)中的自由能分解。这两种方法已被成功地用于热点区域的预测。此外，PASS 软件也可以用来测定蛋白质- 蛋白质相互作用界面上的热点区域。Kortemme 和Baker[16]建立了一个简单计算界面残基突变为丙氨酸时蛋白结合自由能变化的物理模型。因此，蛋白质- 蛋白质相互作用的界面虽然较大，但小分子并不需要覆盖整个作用界面，它只要能够与界面上的热点区域有很好的作用，就可以干扰或抑制蛋白质与蛋白质的结合。一般而言，热点区域较少且相