内容发布更新时间 : 2024/7/2 22:32:35星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

重组 DNA的含义是什么? ①目的基因的获得。②运载体的选择。③内切酶切割。④连接酶连接。⑤宿主菌。⑥重组DNA的转化。⑦转化子的筛选。1.什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificaton system, R-M system)，细菌的限制—修饰系统有什么意义? 即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-M system。限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。 这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。

5.列出一个转座子插入到一个新位点所要求的步骤。 ① 复制型转座：发生转座的整个DNA序列是原转座因子的一个拷贝，转座伴随着新拷贝的复制。 a.转座酶对供体转座子的末端反向重复序列和受体靶位点序列的DNA双链进行特定长度的交错切割； b.共同的机制使转座子和靶序列的切口末段发生交叉共价连接，形成单链转移复合体； c.DNA聚合酶利用连接缺口处的3’-OH末端和模板链填补缺口，完成转座子及正向重复序列的复制，最后将供体复制子与受体复制子分子连接成具有两个转座子的共联体，两个拷贝的转座子位于两个复制子的连接处，方向相同，正向重复； d.由拆分酶催化在两个转座子拷贝之间的同源重组交换，释放出两个独立的复制子，另一个复制子则获得了被复制的转座子，并在转座子的两端形成与最初发生错切长度相同的，短的正向重复序列。 ②非复制型转座：转座因子作为一个整体直接从原始位点插入转座到新的靶位点，而供体原来的位点上已没有转座因子了。有两种转座机制： A.利用供体和受体靶DNA序列的直接连接完成转座，只需转座酶，涉及转座子从供体DNA释放和在靶位点上的插入，在供体位点会造成DNA的断裂，转座子的一条单链与靶位点的单链连接，互补链缺口经修复合成填补，完成转座后同样在转座子两侧形成靶位点序列的正向重复。 B.保守转座：转座酶在转座子两端发生剪切，产生双链断裂，完整的转座子从供体中释放出来，转座子与已切断的靶位点连接，复制、修补缺。

6.描述滚环复制过程及其特征。 过程：单链DNA经复制成为双链复制型（RF），复制的起始是在RF型DNA分子的正链（+）上形成一个切口，当有3’末端外露，5’末端游离后，以另一单环负链（-）为模板开始启动新生正链的前导链合成，游离的5’端按冈崎片段方式启动后随链的合成；随模板链（-）的滚动，新生正链不断在3’末端延伸（共价延伸方式），当其完全游离出亲本单环负链后，自身立即作为模板链按不连续方式合成冈崎片段，经过多轮的滚动，合成出的双链DNA分子是多个基因组串联在一起的多联体，后经切割才形成单体分子。 特征：①新生正链与亲本正链总是连在一起；②滚环复制的DNA图形看似“程只有一个复制叉（单项复制）。

1 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列。 原核生物启动子：上游控制元件（UCE）+核心启动子=扩展的启动子 UCE:即-40～-70区,能与CAP-cAMP复合物结合，是激活转录的正调控位点。

核心启动子：①-35区：Sextama盒，是RNA聚合酶首先识别和结合的位点（R site），或松弛结合位点。保守序列TTGACA,保守序列突变影响

?”字母；③前导链的启动不需要引物，也不需要转录激活，直接在3’—OH端切口上启动复制，整个复制过

?因子结合效率；

②-10区：Pribnow盒，是RNA聚合酶随后滑到区域的结合位点（B site）,或紧密结合位点。保守序列TATAAT,保守序列突变影响开放复合物形成的速度，富含AT，解链发生区；③+1位点：

转录起始点（I site），几乎均为嘌呤（A或P）。④-35区和-10区间有17±1bp的间隔序列，其保守性有利于RNA聚合酶的启动，保证了-35区和-10区能与

?因子同时作用，为RNA转

录提供恒定DNA双链解链区间，17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要，间距的突变趋近17bp时，表现为上调突变，远离17bp时，表现为下调突变。启动子序列与-35区序列为TTGACA及-10区序列为TATAAT的标准启动子序列同源性程度的大小决定了启动子的强弱。

保守序列：指DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，它们在进化过程中基本保持不变。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。从跨种保留的角度来看，这种序列的存在意味着在形成不同物种的进化过程中，有一段特殊的基因序列被保留了下来。 5 说明研究两个已知蛋白质间相互作用关系的酵母双杂交技术的分子生物学原理。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。菌株具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

16.什么是转录起始前复合体? 参与真核生物转录起始的第一步是TFIID因子对TATA盒的识别，TFIID是一组蛋白质的复合体，它包括了TATA盒结合蛋白(TBP)和至少8个以上的TBP辅助因子（TAF），TBP通过DNA的小沟与TATA盒发生专一性作用，并且使小沟变宽，TFIIA作为一种TAF,与TFIID和其中的TBP结合，能增强并稳定TFIID与TATA盒的结合，形成“前转录起始复合

体”（pre-TIC）。简述真核与原核细胞中翻译起始的主要区别。 ①真核生物的翻译起始于甲硫氨酸，翻译起始和多肽延伸中的甲硫氨酸分别由

tRNAiMet和tRNAeMet负载，

而原核生物翻译起始于N-甲硫氨酸（氨基N端发生甲酰化修饰形成N-甲酰甲硫氨酸后去甲酰化），翻译起始的甲硫氨酸由

负载；②真核生物mRNA中没有SD序列，而是以tRNAMetf真核生物特有的5’端帽子结构作为起始因子的结合位点；③真核生物起始定位比原核生物需要更多的间接过程、更多的辅助因子。

4.起始tRNA具有哪两种与其他 tRNA不同的特性? 原核生物起始tRNA: ①因为起始密码一般是AUG（有时使用GUG或UUG），使得起始tRNA负载的始终是甲硫氨酸（Met），当起始上的甲硫氨酸被负载后，其氨基N端立即发生甲基化修饰，形成N-甲酰甲硫氨酸，使后续肽键形成反应只能在甲硫氨酸的羧基端（C）端上进行，保证肽链的延伸只能是NtRNAMetf→C方向；②

Met反密码子臂中缺乏丰富的G/C双链结构，保证了fMet?tRNA进入核糖体P位点还可阻止在形成翻译起始复合体时tRNAMetff进入核糖体的A位点，为第二个氨基酰tRNA进入核糖体留出A位空间。 fMet?tRNAMetf

5.氨基酸分子如何与正确的tRNA分子连接?

负载过程：ATP进入AARS上的ATP结合位点，与随之进入氨基酸结合位点上的氨基酸在羧基和承受臂的3’末端腺苷酸上。

?磷酸之间发生反应，使氨基酸获得AMP，随后AARS将被活化的氨基酸连接到tRNA氨基酸

氨基酸被准确负载于tRNA上的两个重要前提：

①氨基酸分子准确进入并稳定结合到对应AARS的氨基酸位点，准确活化。

氨基酸结合位点的“双筛效应”：双筛结构是指AARS的氨基酸位点上的结合位点和水解位点的两个功能域，由此形成两个不同筛孔的筛板结构，行使对具有相似R基团氨基酸被AMP错误活化后的选择性降解，防止因错误活化而导致错误负载的双筛效应； ②AARS对特定tRNA的准确识别与结合。

AARS对副密码子的识别，为一种AARS所识别的一组同工受体具有相同的副密码子

6.氨酰tRNA合成酶的功能是什么? 氨酰tRNA合成酶：催化特定的氨基酸准确负载于与其对应的tRNA上的专化性酶类。因此AARS具有双重重要的功能，即结合特定的氨基酸与识别对应的tRNA.1种AARS只能识别装载同一种氨基酸的一组同工受体（tRNA分子）。

7.1.衰减作用如何调控E. coli中色氨酸操纵子的表达? 衰减作用根据trp-

tRNAtrp(色氨酰tRNA)的数量去调节Trp操纵子的表达，而trp-tRNAtrp的数量又取决于细胞中

Trp的水平.Trp操纵子mRNA前导序列很长，包括了编码一个长14个氨基酸的多肽所需的全部遗传信息(包括一个AUG起始密码和一个UGA终止密码)。这个多肽含有两个相邻的Trp残基，因此色氨酰-tRNA对前导肽的翻译是必不可少的。

衰减作用发生的必要条件是：1>翻译产生前导多肽；2>转录和翻译的偶联。这样，当RNA聚合酶转录前导序列的同时核糖体就紧接着结合到新生的mRNA上翻译产生前导肽。mRNA的前导序列包括两对相似的反向重复区段。区段2与区段1和3部分互补，这样1+2或2+3或3+4或1+2和3+4都能通过碱基配对形成茎环结构。 由区段3和4配对形成的茎环结构与Trp操纵子的终止子基本相同。和终止子一样，在其茎的3’一侧具有7个连续的U形成的尾巴。当形成这种衰减子结构时，它就能像终止子一样使转录终止。同时，两个Trp密码位于区段1内，而且前导

肽的终止密码在区段l和2之间。 这样，如果色氨酸的量是充足的，那么，trp-

tRNAtrp的含量也能够使前导肽的翻译进行到终止密码UGA。结合的核糖体覆盖了l和2两个区域，

这样1和2、2和3两个区段就不能形成茎环结构，这就使3，4两个区段形成衰减子环并起到终止子的作用，导致RNA聚合酶分子脱离DNA模板。另一方面，如果色氨酸缺乏，那么存在的

trp-

tRNAtrp也很少，导致核糖体停止在两个Trp密码之前，这样核糖体仅盖住区段l，并在区段4被转录之前，区段2和区段3形成茎环结构。这个结构的形成阻止了区段3与区段

4形成终止子结构。于是，出现通读，使操纵子的其他部分被继续转录。事实上，是mRNA上核糖体所在的位置决定mRNA的二级结构和衰减作用是否发生。衰减作用的实质是：通过对存在于引导区内短肽的翻译与否，调控该操纵子的转录延伸。 4.简述RNAi的机制。

RNA干涉可分为起始和效应两个阶段。①起始阶段：加入的小分子RNA或者内源产生的dsRNA被切割为21～23个核苷酸长度的小分子干扰RNA片段（siRNA）。 ②效应阶段：siRNA双链首先与一个核酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。 另一种模型：随机降解的PCR（线虫和植物），依赖RNA的RNA聚合酶RdRP以配对的siRNA为引物，以靶RNA为模板，类似PCR扩增形成dsRNA，然后由Dicer切割形成新的siRNA,进入下一步反应。

简述反义RNA的机制。 存在于细胞质中的反义RNA分子，可与游离的靶mRNA的5’-UTR（原核生物的SD序列）以及编码序列部分结合，形成部分双链引起核糖体结合区域的二级结构发生变化，阻止核糖体的前进，mRNA翻译被迫中断；或者反义RNA与靶序列结合后形成的dsRNA被RNase H降解，抑制了靶基因蛋白质的合成。

存在于细胞核中的反义RNA分子，则可以与前体mRNA结合，如配对区域内有内含子存在，则该内含子受反义RNA分子覆盖，不能被剪切，加工后的mRNA中则包含有内含子的存在，导致前体mRNA的选择性剪接方式的改变；同样的，前体mRNA与反义RNA分子配对形成dsRNA后，被RNase降解。