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青霉菌高产青霉素的工艺研究

Penicillium Technology Research of High Yield of Penicillin

13生工杨雅娴 1308301001

目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。高产青霉素的菌种需经菌种的选育，青霉素的生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。

Worldwide for the production of penicillin producing strain were mostly produced for Penicillium chrysogenum strains, obtained through different ways of improvement. High-yield breeding of penicillin subject to strains of bacteria, penicillin production including fermentation and extraction in two parts. Process flow is as follows: the preservation of species, spore preparation, seed preparation, fermentation, extraction, and refining.

关键词：青霉素、高产、选育方法、工艺

一 青霉素菌种选育方法

抗生素产生菌的菌种选育工作是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗

传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌株，从而促进生产发展。所谓菌种选育，就是利用菌种遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的突变株，提供生产，以稳定提高抗生素产量或得到新的抗生素产品。提高抗生素产生菌的抗生素产量是菌种选育技术的最基本的任务。抗生素是微生物生物合成的产物，由于微生物新陈代谢的特殊性，抗生素发酵生产的原料与抗生素产量并不像化学合成一样有严格的计量关系，采用具有高产优质代谢特性的菌株作为生产菌株，可以在不增加或少增加原料、设备的情况下，大大提高抗生素产量，增加经济效益。

菌种选育技术随着分子生物学、分子遗传学的发展也在不断提高，不断丰富着新的内容。育种技术有自然育种、诱变育种和杂交育种等，随着抗生素合成途径的阐明，菌种选育由诱变结合随机筛选发展成理性筛选，大大提高了筛选频率。

1.1 自然选育

菌种选育最早是利用菌种的自发突变来自然选育，应用菌种自发突变，提高了抗生素生产水平。自然选育是一种纯种选育方法，它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选，排除衰退型菌株。以此来达到纯化菌种、复壮菌种、稳定生产的目的。自发突变是指在没有人工干预下生物体自然发生的突变。微生物以 10-6左右的突变率进行自发突变。生产上将该方法又称为自然分离。在制药企业，一般情况下生产上采用的选育方法为自然选育方法，利用每年的春季、秋季进行菌种的自然分离，从中挑选高产稳定菌株，制备砂土管或深冷管保藏。自然选育的方法经济实用，技术难点低；缺点是正突变率太低，难以大幅提高生产水平。

1.2 紫外诱变选育

紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复合酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用

紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。用 15W 或 20W 紫外灯管，距离15cm～30cm，照射 l0sec—20min。在照射受试菌前，灯管须预热 20min，使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌，使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。

紫外线诱变由于使用方便、效果显著，所以一直以来受到人们的青睐。紫外线诱变操作简单，工厂实验室一般可自制紫外线照射箱来进行紫外线照射处理。

1.3 抗生素诱变选育

诱变育种是抗生素发酵中常用的主要育种方法。它利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株。诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液，常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80)，浓度 0.01％～0.1％。选用最适剂量在高诱变率的前提下，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，即为最适剂量。利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的同时使用，均常呈现一定的协同效应，会取得更好的诱变效果。利用微生物形态、生理与产量间的相关指标，如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等，以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。设计和采用高效筛选方案和方法，以期花费最少的工作量，在最短的时间内，取得最大的成效。诱变育种和其他育种方法相比较，具有速度快、收效大、法简便的优点，缺点是诱发突变缺乏定向性，必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。

1.4 次级代谢产物高产菌株的筛选方法

1.4.1 筛选负突变的回复菌株

选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或者完全丧失、但其它性状仍近于正常突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。因为二次诱变都作用于和抗生素生物合成有关的基因上，动摇了抗生素合成的遗传基础。用此方法得到的突变株，其抗生素合成的酶受到调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负突变株中筛选回复突变株较容易，因为负突变株产量较低或者没有产量，便于从中检出有较高产量的回复突变株。 1.4.2 筛选去碳源分解代谢调节突变株

速效碳源被快速分解利用时，往往对其他代谢途径中的酶（包括许多抗生素合成酶和其他的酶）有阻遏或抑制作用，成为青霉素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产的工艺控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提高青霉素发酵产量具有重要意义。青霉素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制青霉素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可以利用这一性质进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。筛选去碳源分解代谢调节突变株要注意避免走另一个极端，即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是发酵高产的关键。

1.4.3 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株

前体或前体结构类似物对于某些菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株可消除其对产生菌的生长