内容发布更新时间 : 2024/12/29 23:59:04星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

南通大学

分子生物学实验报告

＿＿＿＿ 系＿＿＿＿ 级＿＿＿＿班

学号 ＿＿＿＿＿姓名＿＿＿＿＿

目 录

实验一 组织和细胞RNA的制备 实验二 核酸定量和电泳分析 实验三 逆转录反应

实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增目的基因 实验五 PCR产物的TA克隆（连接） 实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验七 连接产物的转化及重组子的筛选 实验八 质粒DNA的抽提

实验九 质粒DNA分子的鉴定及酶切分析

实验一 组织和细胞RNA的制备

（一)实验原理：TRIzol法提取组织或细胞总RNA

TRIzol可以在破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。 （二）实验步骤： 1.样品处理：

1)培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

2)组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。 2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3. 4℃离心，12000rpm×15min，取上清。

4. 加入0.5ml异丙醇（或与上清等体积），将管中液体轻 轻混匀，静置10min。 5. 4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。

6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500rpm×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。 注：（一）操作注意事项

1. 样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。 2. 实验过程必须严格防止RNsae的污染。 3. 要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。 （二）RNA实验注意事项

RNA实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。