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基于可开启微流控芯片的循环肿瘤细胞捕获及单个细胞的提取

作者：方义 覃璐曼 刘侃 张南刚

来源：《电脑知识与技术》2017年第03期

摘要：介绍了一种可开启微流控芯片。基于细胞的物理尺寸特性该芯片可对外周血循环肿瘤细胞（circulatetumorcells，CTCs）进行分选富集及单个细胞的提取。可开启微流控芯片的结构简单，简化了制作流程。该文以前列腺癌细胞PC3为目标靶细胞，结合显微切割原理，实现了对该细胞分选富集、转印及单个细胞的提取，从而提高了CTCs检测的纯度。本文主要研究了可开启细胞捕获芯片的制作及单个细胞提取的方法。结果表明该芯片可以高效捕获到循环肿瘤细胞并且能从捕获到的细胞中任意提取单个目标细胞，从而为后续探讨肿瘤细胞的生物学机制和转移机制提供了很好的基础与平台。

关键词：循环肿瘤细胞；可开启微流控芯片；单细胞；转印

中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2017）03-0229-03

Circulating Tumor Cell Capture and Single Cell Extraction Based on an Openable Microfluidic Chips

FANG Yi，QIN Lu-man，LIU Kan，ZHANG Nan-gang （Wuhan Textile University，Wuhan 430073，China）

Abstract： An openable microfluidic chip is introduced，which is based on the physical size of the cells， for enriching the peripheral blood circulating cells （CTCs） and extract singlecell. The chip has simple structure and simplifies the production process. In this study， the prostate cancer cellsis used as the target cell， combined with the principle of micro-cutting， achieved the cell sorting enrichment， transfer and single cell extraction， thereby enhancing the CTCs detection purity. In this paper， we mainly study the fabrication of cell-capture chip and the method of single cell extraction. The results showed that the chip could efficiently capture the circulating tumor cells and could extract a single target cell from the captured cells， thus providing a good foundation and platform for the follow-up study of the biological mechanism and metastasis mechanism of tumor cells

Key words： circulating tumor cell；openable microfluidic chip； single cell； transfer 肿瘤是目前危害人类生命健康最严重的疾病之一。近20 年来，我国癌症发病率和死亡率呈明显上升趋势[1]。目前现代医学的治疗方法可以预防原发肿瘤细胞的生长，但是越来越多

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生物学和临床研究结果表明肿瘤患者致死的主要原因是由于肿瘤的侵袭和转移而并非原发病灶。肿瘤转移疾病所引起的死亡占实体瘤所致死亡的90%左右，因此肿瘤转移的早期准确检测就显得尤为重要[2]。循环肿瘤细胞（CTC）是指脱离原发肿瘤病灶，侵袭并进入淋巴管、血液等循环系统的肿瘤癌症患者外周血中的循环肿瘤细胞，常用作肿瘤转移的可靠生物标志物检测和预后监测[3-4]。但是CTC在外周血中的含量极低，约109个细胞中才会发现1至10个，因此CTC的检测及分离在技术实现上非常具有挑战性[5]。就目前而言，主要面临的两大挑战：捕获效率和纯度。

CTC检测常用的方法主要有两种[6-7]，一种是基于细胞的生物化学特性也就是特定抗原抗体[8]之间的反应，另一种则是基于细胞的物理特性，如细胞间的物理特性差异，如尺寸[9]、形变[10]、密度[11]、磁性[12]等。前者应用免疫学基本原理对癌细胞进行相应的处理，这种方法需要专业技术人员操作并且成本高、通量小，如常用的流式细胞仪（flowcytometry，FC）、CellSearch检测系统等。由于循环肿瘤细胞的特异性，因此对于分选富集的细胞而言有漏判的嫌疑，不能很好对未被特异性结合的细胞而有可能是肿瘤细胞的进行捕获及分析，也不能很好的对单个细胞进行操作。后者利用癌细胞与正常细胞在物理特性对癌细胞进分析处理，这种方法原理简单、成本低、通量大，但是对于分选富集到的细胞同样存在单细胞分离及分析困难的问题。

针对以上两点问题，本文采用了一种低成本、高效的可开启微流控芯片来实现CTC的分选富集，并充分利用石蜡的转印和芯片可开启对细胞进行提取。 1实验部分

1.1 微流控芯片的原理

基于细胞尺寸分选系统的基本设计如图1所示。微流控芯片由高度连续变化的玻璃上盖片、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）构成粘合层和含有凸台的玻璃下盖片构成。设计的基本思路是：芯片捕获区域主要由一个高度连续变化的区域构成，当混有CTCs健康人血样流经该区域时，由于循环肿瘤细胞相比于正常细胞而言：细胞刚性较大不易变型，尺寸也比正常细胞（如红细胞，血小板等）要大，因此CTCs会按照不同大小会停留在相应高度的位置，一些比出口小的细胞（如红细胞、血小板等）和刚性较小的细胞会随着液体流走，从而实现了细胞的分选富集。

图1 细胞分离示意图 1.2 芯片设计与制作 1.2.1 芯片设计

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以75mm×25mm光学玻璃片为基片，制作上盖片长为62mm，上端宽5mm，下端宽15mm，最高处60μm，最低处5μm的楔形沟道（图2（b））；制作下盖片长为68mm，上端宽19mm，下端宽9mm的凸台（图2（c））；出入口孔径均为0.6mm，出口沟槽为宽为1mm，深度为0.2mm。

图2 芯片设计 1.2.2 芯片的制作

首先使用耐刻蚀的胶膜制作出沟道的掩膜与凸台的掩膜，然后采用湿法刻蚀的方法，制作出楔形沟道与凸台，再使用JDLGC16_A8精雕机分别使用0.6mm单粒度磨头、转速

7500rpm，吃刀深度0.02mm及1.0mm单粒度磨头、转速13000rpm，吃刀深度0.02mm在带有楔形沟道的上盖片上加工出入口、出口及出口沟道，再将加工好的上下盖片在超声清洗机中经丙酮、无水乙醇及去离子水依次超声清洗，通过电晕处理后再在去离子水中合在一起后放在80℃的热台上烘干所有水分，这时上盖片与下盖片这间已经有一定的分子键合力。在烘干的过程中，将PDMS树脂与固化剂按10：1的质量比混合，充分搅拌均匀，除去所有的气泡，待芯片烘干后将PDMS浸入至芯片凸台周围直到PDMS完全浸没整个凸台周围，随后将芯片置于80℃热台上30至60分钟，待固化后去除芯片周围多余的PDMS，这样最终就得到了可开启的微流控芯片。 1.3 芯片操作

前列腺癌细胞（PC3）细胞株的培养液为RPMI1640与胎牛血清以9：1的培养基，细胞培养于50mL培养瓶中，培养瓶置于二氧化碳培养箱，温度为37℃，二氧化碳质量分数为5%，加入胰酶进行消化，将洗涤后的PC3细胞用磷酸盐（PBS）缓冲液按质量比1：10进行稀释，取1ml于试管并加入FDA，使其终浓度为100 μg.ml-1，置于室温30min，期间用移液枪吹打几次以确保细胞与FDA染色试剂充分接触，然后取终浓度为0.4%的PFA与细胞溶液按1：20的比例将染好色的细胞进行固定，最后利用注射器吸取适量细胞溶液，通过保定兰格微量注射泵以100μl/min的流速注入芯片，图3为该芯片在通血时的图片。10min后换用PBS缓冲液冲洗，然后依次通入75%、80%以及100%的乙醇，最后通入液态的低温石蜡将所捕获到的细胞封闭在楔形沟道里。

接下来将捕获到细胞的芯片放置于显微镜中，随机取点观察细胞的位置及数量，再将芯片放置于42℃的水中，用刀片将芯片分开，这里就可以得到完整包含石蜡的下盖片与上盖片。对完整包含石蜡的下盖片进行观察，可以看到，随机取到的点中的细胞位置及数量。 单细胞提取采用以下步骤：