分子生物学实验教案2010 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/12/23 8:03:11星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

分子生物学实验教案

【实验注意事项】:

1、 在进行诱导实验中要注意以含有空载体pET 28c的BL21菌株以及IPTG诱导前的含有

pET 28c重组子的BL21菌株做对照。

【思考题】:

1、 IPTG是如何诱导目的基因表达的?

2、 有人说克隆基因相对比较容易,使外源基因表达尤其是高效表达就比较难,你认为呢?

【实验后记】:

实验14 SDS-PAGE检测目的蛋白

【时间安排】:3 学时 【实验类型】:综合

【目的要求】:

1、 了解:聚丙烯酰铵凝胶电泳的基本原理; 2、 掌握:SDS-PAGE检测目的蛋白的实验技术;

3、 熟悉:SDS-PAGE试剂配制、蛋白质提取的实验过程。

【实验原理】:

电泳是带电颗粒在电场的作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象,影响泳动速度的因素主要有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。聚丙烯酰铵凝胶(PAG)是常用的电泳介质,它是由单体丙烯酰铵(acrylamide)和交联共聚单位双体N,N-甲叉双丙烯酰铵位材料,在引发剂过硫酸铵(APS)和增速剂四甲基乙二胺(TEMED)的作用下聚合交联形成含酰胺基侧链的脂肪族长链,在相邻长链之间通过甲叉桥连接而成的三维网状结构物质。 SDS-PAGE(即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳)主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基分子量。SDS是一种阴离子去污剂、变性剂、助溶剂,它能断裂分子内和分子间的氢键和疏水键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级和三级结构;还原剂,如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚成单个亚基。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带有负电荷的蛋白质-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。使蛋白质分子的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中,特别是样品制备过程中蛋白质和SDS的结合程度,其影响因素主要是:(1)溶液中SDS单体的浓度;(2)样品缓冲液的离子强度;(3)二硫键是否完全被还原。

SDS-PAGE具有浓缩效应(不连续缓冲系统);电荷效应;分子效应等。

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分子生物学实验教案 【仪器与试剂】:

主要仪器:电泳仪、蛋白电泳槽、制胶板、电炉、离心机、水浴锅、台式脱色摇床、冰箱、冰盒、制冰机等

主要试剂:蛋白质标准分子量、APS、TEMED、Tris、SDS、Glycine、Acrylamide、bis、盐酸、考马斯亮蓝R-250、甲醇、冰醋酸、甘油、溴酚蓝、DDT、β巯基乙醇等。

【重要实验步骤和教学设计】:

1 样品蛋白质提取:将IPTG诱导前的样品及诱导后的样品(包括诱导1、2、3、4、5小

时的样品),5000rpm离心5min,得上清液和沉淀。沉淀中分别加入200μL冰预冷的磷

酸缓冲液(pH7.4)悬浮细胞,洗涤后5000rpm离心5min,回收菌体沉淀,加入30μL Ph7.4的PBS缓冲液盒10μL的4X SDS loading buffer,剧烈振荡悬浮溶解菌体;上清液30μL,添加10μL的4X SDS loading buffer,混匀。将上清液和沉淀样品分别在100℃沸水中5min,立即放入冰箱或冰浴中冷却。 2 SDS-PAGE母液配制:

(1)30%Acr-Bis贮液:称取30克丙稀酰胺和0.45克甲叉双丙稀酰胺,加双蒸水溶解后定容到100mL。过虑后使用。4℃下可存放1个月左右。

(2)分离胶缓冲液(0.57M pH=8.8 Tris-HCl):称取20.7g Tris,用少量水溶解后,以1N HCl调pH=8.8后,定容到100mL。4℃下存放。

(3)浓缩胶缓冲液(0.18M pH=6.8 Tris-HCl):称取4.36g Tris,用少量水溶解后,以1N HCl调pH=6.8后,定容到100mL。4℃下存放。

(4)10%SDS:10克SDS溶解于100mL水中,室温存放。

(5)10%过硫酸铵:100毫克过硫酸铵溶解于1mL水中,一周内使用。

(6)电极缓冲液(pH=8.3):称取15克Tris,72克甘氨酸和5克SDS,溶解于适量水中后,以1N HCl调pH=8.3后,定容到1000mL。4℃下存放。用前稀释5倍。

(7)样品提取液:4.2 mL dH2O + 1 mL 0.5M Tris-HCl(pH=6.8) + 0.8mL 甘油 + 0.4mL 巯基乙醇 + 1.6mL 10% SDS——8mL

(8)1N HCl:8.5mL 36% HCl (比重1.19) 加水定容至100mL。

3 制胶:

(1)10%分离胶配方: (2)3.6%浓缩胶配方: 30%Acr-Bis贮液 10 mL 30%Acr-Bis贮液 2 mL 分离胶缓冲液 10 mL 浓缩胶缓冲液 5 mL 10%SDS 0.3 mL 10%SDS 0.1 mL 10%过硫酸铵 50~100μL 10%过硫酸铵 30~70μL TEMED 40μL TEMED 20μL ddH2O 8 mL ddH2O 2.5 mL 总体积 30 mL 总体积 10 mL 4 点样和电泳:点样量10~20μL,8~20mA恒流,直至溴酚蓝标记离开分离胶。 5 染色:凝胶经0.04%考马斯亮蓝R-250、12%三氯乙酸染色1~2天后,用自来水脱色。

【实验注意事项】:

1、 提取样品蛋白要严格按照程序进行;

2、 注意凝胶储液浓度,特别是含有几种药品的溶液,不能弄错; 3、 制胶、剥胶要小心,保持凝胶的完整性; 4、 电泳方向要准确,电流要适当。

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分子生物学实验教案

【思考题】:

1、 实验过程中存在什么问题?原因在哪? 2、 是否检测到目的蛋白,为什么?

【实验后记】:

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