内容发布更新时间 : 2024/12/23 2:00:00星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

实验二 双水相萃取 α-淀粉酶的分配平衡实验 一、实验目的与要求

1掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。 2了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。

3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸铵体系双水相萃取实验操作。

4明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 等因素对 α-淀粉酶分配系数的影响。 二、实验器材和试剂

1. 实验器材 :低速离心机;酸度计;涡流混合器;分光光度计

2. 实验试剂 :PEG :(分子量分别为 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸铵、 α-淀粉酶、 磷酸氢二 钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理

双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛,最常采用的双水相体系是 PEG/Dex或 PEG/低分子盐系统, 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。

PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。 T 为上相浓度, B 为下相浓度 , C 为系统临界点, TCB 为临界线 或双节线,双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水 相萃取分配系数 K=Ct /Cb ,为上相和下相的浓度比。

双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和 离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得 特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。

相图中 TMB 为系线,其长度由相组成的总浓度决定,表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋 近于零,表示上相和下相的组成相同,因此分配系数应为 1。随着 PEG 、硫酸铵和盐浓度增大,系线长度 增加,上相和下相相对组成的差别就增加,酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。

本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究 α-淀粉酶的分配,具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和 添加 NaCl 浓度对 α-淀粉酶分配系数的影响。

参考:-淀粉酶是广泛应用的生物酶类, B.Subtilis 细菌 α-淀粉酶是研究和应用较多的 α-淀粉酶, 其分子量为 48 KD , PI 约为 5,最适 pH5.3-6.4,在 pH4.8-8.5之间稳定。

四、实验步骤

1. PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制(全班都做

配制 40%PEG1000和 43%硫酸铵原液(没有混合前的液体,混合后浓度是相图中最终浓度

,分别取

0.7gPEG1000、 2000、 4000、 6000原液(PEG10002000、 4000、 6000密度分别为 1.037g/mL、 1.066 g/mL 、 1.03 g/mL 、 1.07,因此加入 0.7g 对应体积分别为 0.68 mL、 0.66mL 、 0.68 mL、 0.66 mL ,加入 0.5mL 水,按图 1流程绘制相图,按表 1记录数据。注意少量多次加入硫酸铵原液,系统出现浑浊时记录加入硫 酸铵体积,计算重量(43%硫酸铵原液密度为 1.2g /mL , 再加入适量水,使体系变澄清,计量加入的水, 再加硫酸铵,使系统再次变混浊,如此反复操作,原液冰箱放置。将数据记录到表 1中,计算系统混浊不 同时刻 PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分浓度(或质量体积百分比 ,绘制 PEG 和硫酸铵的双水相相图。

第 1组同学做 PEG 分子量 1000的相图,第 2、 3、 4组分别做 PEG 分子量 2000、 4000和 6000的相图。