内容发布更新时间 : 2024/5/25 10:59:00星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

G-LISA法：高效快捷的小G蛋白活化检测方案

基础知识背景 — 什么是小G蛋白？

小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同时具有GTP酶活性，小G蛋白家族成员在细胞信号通路中发挥分子开关的功能，参与调控很多生物学过程。小G蛋白的共同特点是，当结合了GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则恢复到非活化状态。这一点与G蛋白里的Gα类似，但是小G蛋白的分子量明显低于Gα。在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。

第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的产物。小G蛋白的Ras超家族由超过150个成员组成，基于它们的序列同源性，被分成若干亚家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。

小G蛋白超家族成员及其相关功能：

亚家族

功能

成员

Ras 细胞增殖

DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRAS; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2

Rho

RHOA; RHOB; RHOBTB1; RHOBTB2; RHOBTB3; RHOC; RHOD;

细胞骨架的

RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1;

动力与形态

RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42

Rab 膜转运

RAB1A; RAB1B; RAB2; RAB3A; RAB3B; RAB3C; RAB3D; RAB4A; RAB4B; RAB5A; RAB5B; RAB5C; RAB6A; RAB6B; RAB6C; RAB7A; RAB7B; RAB7L1; RAB8A; RAB8B; RAB9; RAB9B; RABL2A; RABL2B; RABL4; RAB10; RAB11A; RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14; RAB15; RAB17; RAB18; RAB19; RAB20; RAB21; RAB22A; RAB23; RAB24; RAB25; RAB26; RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; RAB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38; RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL; RAB40B; RAB40C; RAB41; RAB42; RAB43

Rap 细胞粘附 RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C

Arf 囊泡转运

ARF1; ARF3; ARF4; ARF5; ARF6; ARL1; ARL2; ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C; ARL6; ARL7; ARL8; ARL9; ARL10A; ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13B

Ran 核运输 RAN

Rheb mTOR途径 RHEB; RHEBL1

RGK

RRAD; GEM; REM; REM2

Rit

RIT1; RIT2

Miro 线粒体转运 RHOT1; RHOT2

Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通（membrane traffic），其他家族成员也在细胞信号通路中发挥着非常重要的作用。

因此，研究GTP酶（GTPase）的活化调控机制具有广泛而深远的生物学意义。传统检测Rho 蛋白活化水平的方法主要为pull-down检测。pull-down法往往存在耗时长、需要样本量大、不太适合高通量检测等缺点。为克服传统方法这些方面的缺点，Cytoskeleton公司开发了新一代的G-LISA?检测方法，用于快速简便地检测GTP酶活化水平。

G-LISA实验原理及操作步骤

1.首先将效应蛋白的受体结合域（RBD）包被96孔板；

2.样本中GTP(活化状态)结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而GDP(无活性状态)结合形式蛋白则不结合； 3.洗去未结合的蛋白；

4.然后依次加入特异性的一抗和HRP-二抗进行孵育结合； 5.最后利用合适的酶底物OPD或化学发光试剂显色。

Swiss 3T3 细胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）