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DNA分子标记技术在农作物种子纯度检验中的应用

摘要：

种子是重要的农业生产资料，种子纯度是保证农作物品种增产潜力得以发挥的关键 因素，开展种子纯度鉴定对保证种子质量具有重要意义。随着现代分子生物学的发展，DNA 分子标记技术在种子纯度鉴定上的应用越来越广泛。本文通过对 RFLP、RAPD、AFLP 和 SSR 等几种常用的分子标记技术的原理及其在种子纯度鉴定上的应用，分析了各技术的优缺 点，为种子纯度鉴定技术的选择提供依据。 种子是农业生产最基本的生产资料，种子质量的优劣直接影响到农业生 产，而在衡量种子质量的纯度、净度、发芽率和水分四项指标中，纯度最为重 要。品种纯度检验包括两方面的内容，即种子的真实性和品种纯度。种子的真 实性是指一批种子所属品种、种或属与文件描述是否相同。品种纯度是指品种 个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、 穗数）占供检验本作物样品种子数的百分率表示 [1]。品种真实性和品种纯度是 保证良种优良遗传特性得以充分发挥的前提，是正确评定种子等级的重要指 标。

品种纯度检验的方法很多，根据其所依据的原理不同主要可分为形态鉴 定、物理化学法鉴定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定和细胞学方法鉴 定。形态鉴定分为籽粒形态测定、种苗形态测定和植株测定。籽粒形态测定虽然简单快速，但仅适合于籽粒较大、形态性状丰富的作物，测定结果受主观影 响较大。种苗形态测定，适合于十字花科、豆科等幼苗形态性状丰富的作物， 而且苗期所依据的性状有限，测定结果不太准确。植株形态测定依据的性状较 多，测定结果较准确，但测定需要时间长，难以满足快速测定的需要。物理化 学方法虽然测定速度快，但其区别的种类较少，难以满足品种纯度准确测定的 要求。生理生化法包括的技术较多，如愈创木酚染色法、蛋白质或同工酶电泳 法、免疫技术鉴定等，其中电泳法可以相对准确地测定品种纯度，是目前品种 纯度测定中较为快速准确的方法。细胞学方法主要依据染色体数量和结构变 异、染色体带型差异以及细胞形态的差异区分种及品种，在品种纯度测定中应 用价值不大。

分子生物学方法是 20 世纪 90 年代迅速发展起来的，分子生物学方法种类 非常多，根据国际植物遗传资源研究所 Karp 等（1997）的分类方法，将目前应 用的 DNA 分子技术分为 3 类：非 PCR 技术、随机或半随机引物 PCR 技术、特异 PCR（目标位点 PCR）技术。目前在品种检测中最常用的分子技术主要有 RFLP 技 术 (Restriction Fragment Length Polymorphism) 、 RAPD 技 术 ( Random Amplified Polymorphisimic DNA) 、 AFLP 技 术 (Amplified Fragment Length Polymorphism)以及 SSR 技术(Simple Sequence Repeat)。分子标记是在 DNA 水 平上对基因型的标记，直接以 DNA 形式表现，数量多、多态性高，在植物的各 个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问 题。而且许多分子标记表现为显性或共显性，能够鉴别出纯合和杂合的基因 型。分子标记技术克服了其他方法的种种问题，又具有以上这些优点，在品种 纯度检验方面有着广阔的应用前景。 1 几种常用分子标记技术

1.1 RFLP 技术 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态 性)是 Grodzicker 等于 1974 年发明的分子标记技术，是检测不同生物个体间基 因细微差异的可靠方法。其原理是：生物在长期的自然选择和进化过程中，由 于基因内个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成种、属间 DNA 的核苷酸序列上出现差异，从而使其具有不同的酶切位点，利用限制性内切酶 切割不同品种的 DNA 时，产生的 DNA 片段的数目和大小将不同，通过电泳，再 进行 Southern 转移到膜上，利用放射性同位素

(通常为 32P)，用该探针与支持 膜上的 DNA 杂交就能得到 DNA 的限制性片段多态性，从而将不同品种的种子区 分开来[2]。

该标记是最早在 DNA 水平上用于品种鉴别和种子纯度分析的技术，自 20 世 纪 80 年代将 RFLP 标记应用于植物以来，目前已广泛应用于玉米、小麦、大 麦、水稻、黄瓜等作物的品种鉴别。Mastuura 等[3]利用 2 个 RFLP 克隆作为探针 对黄瓜亲本及其 F1 杂交种进行 RFLP 分析，结果表明该方法能够快速、准确地 测定出 F1 杂交种的纯度。RFLP 标记大多数为共显性标记，在分离群体中能区分所有可能的基因型，并且无上位效应，特异性强、准确性高，但其过程繁 琐、周期长，操作难度较大，耗费高，同时需要大量纯度较高的 DNA 用于分 析，且常常使用同位素，危险性大。这些缺点都限制了 RFLP 标记技术在种子纯 度及品种真实性鉴定中的应用。

1.2 RAPD 技术 RAPD(Random Amplified Polymorphisimic DNA，随机扩增多态性 DNA)是 1990 年由美国科学家 Williams 和 Welsh 几乎同时采用 PCR 技术发展起来的， 它利用随机引物(一般为 9～10 个碱基) 对不同品种的基因组 DNA 进行 PCR 扩 增，产生不连续的 DNA 产物，再通过电泳分离检测 DNA 序列的多态性，得到多 态性的 DNA 谱带从而鉴别不同的品种。

RAPD 技术鉴定种子纯度的基本原理就是以该品种 RAPD 图谱中某一特异谱 带的出现与否加以判断的[4]。RAPD 应用于常规品种种子纯度检验时，要求选择 目标品种的 RAPD 图谱中出现而其他常规品种中不出现的 DNA 谱带作为鉴定纯度 用的特异谱带。为保证检测结果的真实性和可靠性，寻求特异谱带的研究中通 常选用较多的其他非目标常规品种。高蓝等[5]用 RAPD 方法完成了对番茄种子纯 度的初步鉴定。戴修纯等[6]利用 RAPD 技术鉴定两个番茄一代杂种的种子纯度， 建立了适合于番茄 RAPD 分析的程序，并从 100 个随机引物中筛选到十几个合适 的随机引物，能快速、准确地鉴定 F1 种子的纯度。刘静等[7]以白菜型油菜新品 种“白杂 1 号”父母本及 F1 代种子为研究材料，用 238 个 RAPD 随机引物对其 分析鉴定，经多次重复验证，引物 S24、S83 和 S104 条带稳定，并且杂交种条 带为双亲互补型；人为掺杂构建“白杂 1 号”F1 代测试群体，用 S104 对其进 行了纯度检测，结果与预期结果基本一致。在鉴定种子纯度中运用双引物混合 扩增，也只出现父本特异谱带，母本特异谱带没有出现，这与蒲汉丽等 [8] 的试 验结果一致。

RAPD 引物无种属特异性，一套随机引物可用于不同作物基因组分析；RAPD 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行指纹图谱的构 建及遗传多样性分析，快速简便，无放射性污染，成本较低，分辨率高，灵敏 度强；用 RAPD 构建基因图谱不需要克隆，不涉及 Southern 杂交、放射自显影 等繁琐程序，DNA 用量极少。但 RAPD 标记是一个显性标记，不能区分杂合子与 纯合子，试验稳定性和重复性较差；不同引物之间的扩增结果重复性和稳定性 相差较大，能够稳定重复的引物相对较少，引物筛选工作量大；对于用已经筛 选出的适合玉米种子纯度及真实性鉴定的引物进行 DNA 指纹分析，比较方便、 快捷、准确，但是对于以前未检测过的新品种，要想在短时间内筛选到合适的 引物进行鉴定，难度很大；另外，RAPD 存在共迁徙问题，即只能分开不同长度 的 DNA 片段，不能分开长度相同、但碱基序列不同的片段。因此，在使用此技 术的时候应注意扬长避短[9,10]。

1.3 AFLP 技术

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性) 标记是由 Zabeaumare 发现，并由 Vospieter 等发展起来的。其基本原理是将 DNA 用可产生粘性末端的限制性内切酶消化产生大小不同的酶切片段与含有共 用粘末端的人工接头连接，作为进一步扩增的模板。根据需要通过选择在末端 上分别增加 1～3 个选择性核苷酸的不同引物，使得引物能选择性识别具有特异 配对顺序的内切酶片段，扩增的内切酶片段通过聚

丙烯酰胺凝胶电泳分离检 测，产生扩增片段长度不同的多态性带型。AFLP 是 RFLP 和 PCR 相结合的一种 技术，既有 RFLP 的可靠性，也有 RAPD 的灵敏性。通过少量引物就扩增产生了 数量丰富的带型，重复性好、分辨率高，且对所需 DNA 模板浓度的变化不敏 感。AFLP 技术已被广泛应用于作物遗传育种的各个领域，由于它可以分析基因 组较大的作物，其多态性很强，利用放射性标记在变性聚丙烯酰胺凝胶上可检 测到 100～150 个扩增产物，非常适合绘制品种的指纹图谱，鉴定品种的真实性 和纯度。刘杰等[11]从杂交油葵 A15 及其亲本的 1/2 干种子中提取基因组 DNA， 选用 17 对引物组合进行 AFLP 分析，构建了它们的指纹图谱，进一步实验表 明，AFLP 标记检测油用向日葵品种杂交种子的纯度是可行的。Smith 等(1993) 利用 AFLP 技术对 44 个玉米自交系进行分析，认为 AFLP 是一种很准确的方法, 可以将亲缘关系很近的自交系区分开。法国 Faye(1996)用 1 个 AFLP 引物就在 玉米的 2 个基因型中发现 30 条以上的多态性谱带，认为十分适合玉米基因型的 指纹鉴定；但由于实验对 DNA 纯度和内切酶的质量要求较高，基因组不完全酶 切会影响实验结果，操作程序长、步骤多，并要求很高的实验技能和精密的仪 器设备，因而难以在作物种子纯度及真实性鉴定中普及应用。

1.4 SSR 技术 SSR(Simple Sequence Repeat ， 简 单 序 列 重 复 ) 又 叫 微 卫 星 DNA(Microsatellite DNA)，一般是指由 1～6 个核苷酸组成的基序(motif，或 称基本重复单位)以串联排列的方式组成的 DNA 序列，它们的长度大都在 100bp 以内，其中以二核苷酸为基序的微卫星序列最为丰富。由于基本重复单元次数 不同，从而形成 SSR 座位的多态性。每个 SSR 座位两侧一般是相对保守的单拷 贝序列，因此可根据两侧序列设计一对特异的引物来扩增 SSR 序列。经电泳， 比较扩增带的迁移距离，就可知不同个体在某个 SSR 座位上的多态性 [4,9] 。可 见，检测 SSR 标记的关键在于设计出一对特异的 PCR 引物，为此必须事先了解 SSR 座位两侧的核苷酸序列，寻找其中的特异保守区。虽然 SSR 标记必须依赖 测序设计引物，开发成本高，不过现在很多物种都已有现成的、商品化的 SSR 引物，有利于 SSR 标记技术的发展。目前 SSR 标记已广泛应用于玉米、水稻、 小麦等农作物杂交种纯度鉴定。吴永升等[12]以桂单 22 号玉米杂交种及其亲本和 10 对玉米 SSR 位点引物为材料，筛选出适合的引物，并对利用嫩芽和干种子为 材料提取的 DNA 进行比较，发现两种方法提取的 DNA 无明显差异，建立了一套 利用 SSR 标记技术快速、简便进行玉米杂交种纯度鉴定的技术规程。姚凤霞等 [13] 以掖单 13 号玉米杂交种及其亲本自交系为材料，对 15 对 SSR 引物进行筛选，选出适合该杂交种纯度鉴定的 SSR 位点引物，建立了利用 SSR 分子标记技 术检测掖单系列玉米杂交种纯度鉴定的方法。

SSR 技术具有以下特点：(1)数量丰富,覆盖整个染色体组；(2)每个位点均 有许多等位形式，多态性丰富，信息含量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显 性；(4)易于利用 PCR 技术分析，对 DNA 数量及质量要求不高，即使是部分降解 的样品也可进行分析；(5)实验程序简单，耗时短，结果重复性好；(6)每个位 点由引物序列顺序决定，便于各实验室交换数据。SSR 标记完全符合作物品种 鉴别的 4 个基本准则：环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内 变异性和实验结果的可靠性。因此，可高效准确地检测生物体中的遗传变异， 在种子纯度及品种真实性鉴定中具有良好的应用前景。他们都认为 SSR 标记具 有很高的多态性,非常适用于品种鉴定研究。但石海波等[14]在利用 SSR 标记检测 小麦品种种子混杂时，发现了 SSR 位点存在不纯的现象，并指出这一现象在小 麦品种中普遍存在。种子混杂和 SSR 位点不纯都会造成株间 SSR 带型的差异， 有可能将 SSR 位点不纯造成的株间带型差异误以为是种子混杂。因此当用 SSR 标记进行小麦品种纯度鉴定时，应注意以下几点：(1)必须进行多个位点的检 测；(2)当某单株的多个 SSR 位点的带型与被检测品种不同时，可确定为混杂植 株；(3)剔除混杂植株后，如某单株的个别 SSR 位点的带