内容发布更新时间 : 2024/5/6 4:35:58星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

1H-NMR 代谢组学

样本处理——双相提取法 细胞

1. 收集细胞，1500rpm/min，5min，4℃离心，弃上清 2. 预冷PBS洗两次，1500rpm/min，5min，4℃离心。

3. 将细胞转移至2mlEP管中，PBS润洗离心管，对应转移。

4. 小离心机2000rpm/min，5min，4℃离心，弃上清（尽量倒干净，倒扣用纸吸干）。 5. -80℃/液氮保存（1年）

6. 向各管细胞沉淀中加入预冷甲醇：氯仿=2:1, 900ul，涡旋混匀（最大转速）10min。 7. 细胞超声破碎仪，超声3s/次，共3次，中间间隔3s（冰上操作）。 8. 加入300ul预冷氯仿。

9. 加入540ul预冷miniQ水，涡旋混匀（最大转速）10min，冰上静置10min。

10. 13000rpm，20min离心，体系分为三相，即上层水相+甲醇；下层为氯仿；中间为未裂

解细胞和细胞碎片以及蛋白质。

11. 分别取上层水相和下层有机相于不同的EP管中，可-80℃/液氮保存。 12. 下层有机相氮吹和上层水相氮吹后冻干。

13. 冻干后每管加入500ul重水，涡旋混匀5min。

14. 水相12000g/min，5min，4℃离心；有机相200g/min，5min，4℃离心。 15. 取上清加入核磁管中，送样检测。 组织

1. 称取20~200mg冰冻组织，并准备预冷甲醇、氯仿、miniQ水。

2. 将冰冻组织置于玻璃管内，按体积加入4ml/g甲醇和0.85ml/g水到组织样品中，超声破

碎样品并涡旋混匀。

3. 加入2ml/g氯仿，再次涡旋混匀2min，静置2min。 4. 加入2ml/g氯仿和2ml/g水，再次涡旋混匀。

5. 将样品置于冰上或冰箱中静置15min后，1000g，15min，4℃离心（如无明显分层，则

再次离心）。

6. 将上层水相与下层氯仿相分别转移到玻璃管中，氮吹后-80℃/液氮保存。 7. 真空低温冻干样本后，马上检测。 8. 若不立即进行检测，则将水相提取物储存于-80℃，将脂相提取物保存于氘代有机溶剂中

（主要为降低氧化反应），并储存于-80℃（但最好不要超过3天）。 9. 水相代谢物：加入580ul重水，含0.1~0.5mM TSP，涡旋混匀，12000g，5min，并将550ul

样品置于核磁管中检测。

10. 脂性代谢物：加入580ul氘代氯仿，含0.03V/V TMS，涡旋混匀，1000g，5min，并将

550ul样品置于核磁管中检测。

数据分析

NestReNova A． Open-fid-1. Automatic Phase Correction

2.TMS定标：含TSP内标定0；不含TSP内标定乳酸1.336 3.Baseline Correction：1

按顺序打开文件并保存（根据所需比较组别按顺序排列样本后依次打开，并记录清楚）。

B． 另存为文件

1. 全选-叠加峰-Delate其他图

2. 积分区间9.5~0.5（可变，自定），间距0.002或0.004

去掉水峰4.7左右（4.6~5.1）

血液、尿液：去掉尿素峰（5.8左右，较宽单峰） 引入的氯仿：去掉氯仿峰7.8~7.6 引入的甲醇：去掉甲醇峰3.37~3.34 3. Processing-Binning（积分） 4. Cut（切除峰）：三个-水峰、氯仿峰、甲醇峰【上方工具栏“cut“-“Manualled cut“】 5. 归一化：Processing-Normalize（10000）-保存为txt格式

6. 用excel打开，剔除”以去掉”三段积分值，另存为excel（2003版）

7. 在excel中编辑数据，插入两行，按顺序，第一行为1,2,3,4，….(样本个数)；第二行为

1,1,1,1，…;2,2,2,…(1为组1样本；2为组2样本)。

SIMACA-P+

C．验证异常点有无

1. 新建-导入excel文件-transpose- 横1：Primary；竖1：Primary；竖2：Y-Variable 2. 双击-workset-Variables-去掉Var-1-分组；Scale-type-全选-ctr-set

3. Analysis-change Model Type（PLS）-PCA on X-block-上方工具栏（caculate the first

two-components）

左侧工具栏“PCA plots“-“t[1]/t[2]Scatter Plot(单个图)“ 上方工具栏“ “同时显示4个图 “Distance to Model X【M1】“图中，纵坐标为依据，高于基线值2倍的点为异常点 R2X,R2Y无要求，斜率接近，Q2Y>0.4(动物样本)；Q2Y>0.2(人体样本)

D. PLS-DA分析（包含Var-1，在Variables中恢复） 1. 选中M1 PCA-X ，New as model，Edit 2. 分组（observation）

3. Scale（全选）- Par（type）-set-确定-Not to all

4. PLS Discrimination-上方工具栏“ “同时显示4个图 5. Validate：Model Plot-200

E．OPLS-DA(包含Var-1)

1. 选中M2 PCA-X ，New as model，Edit

2. Scale（全选）- UV（type）-set-确定-Not to all

3. PLS Discrimination-上方工具栏“ “同时显示4个图 4. Plot/List-Lists-observation and loadings Add series （加2个变量），p；p（corr），确定 复制表格-excel粘贴

5.Analysis-OPLS-加一个变量

代谢物要求：VIP>1; P<0.05

根据 VarID(位移)，M3p[1](loading得分值)，M3p（corr）[1]p(相关系数)，查询代谢物

整理总表1：

代谢物-峰型-标准化学位移（数据库）-真实化学位移（化学位移区间中点值）-相关系数-相关系数对应的化学位移 整理总表2：

代谢物-峰-化学位移-VIP-Fc-P

标准偏差：Model3 OPLS-DA

Workset-statistic-std.dev（标准偏差） 彩图表格： VarID（Primary）/P[1]P(loading)/ P[corr[1]]P(loading)/Loading*sandev（标准方差）*104/105/abs（相关系数）

Loading*sandev（标准方差）*104/105 ，使值在102~103数量级

MATLAB程序：

fx>>JzPlotColorCurve(data(:,1),data(:,2),data(:,3),20); (20表示平滑度，可要可不要)