内容发布更新时间 : 2024/12/23 19:23:11星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
第二章大豆PM18B、PM30多克隆抗体的制备 一、实验材料
二、实验方法
1.PM18B-His和PM30-His的克隆 1.1 引物的设计
通过NCBI(网址www.ncbi.nlm.nih.gov)进入Genbank数据库,查找大豆PM18(AF009953.1)和PM30(AF117884.1)基因碱基序列,应用GeneTool软件,分别设计上下游引物,扩增开放阅读框(ORF)的cDNA序列。PM18B的上下游引物分别命名为PM18AF和PM18AR,分别带有酶切位点pagⅠ和EcoRⅠ;PM30的上下游引物分别命名为PM30AF和PM30AR,分别带有酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ。两个基因的上游引物都带有His标签。引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。两个基因的引物的碱基序列如下: PM18AF:5’CCGTCATGAGGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCAAGACAGCAAT3’ PM18AR : 5'CACGGAATTCTCACATTTTCTCCCTACGA 3'
PM30AF:5’CCGCCATGGGGCATCATCATCATCATCACATGGCATCCCATAGGCAAAG3’ PM30AR:5’CACGGAATTCTTAGTAATTTCTGCGGTTGT3’ 1.2 大豆胚根总RNA的提取
大豆白农6号种子用双蒸水在25℃的培养箱中培养24h,收取刚刚突破种皮的大豆胚根,利用Trizol 法提取其总RNA。方法如下:
(1)将大豆培根放入经液氮预冷的研钵中,迅速研磨成粉末。取50-100mg加入到1 ml Trizol中(粉末体积不要超过总体积的1/10),震荡混匀。 (2)室温(15-30°C)静置5 min。
(3)加入200μl氯仿,用手剧烈震荡15 -30s,彻底混匀,室温放置2-3 min。
大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
(4)4°C,12000g离心15 min,将水相转移到新EP管中。 (5)加入预冷异丙醇500μl,室温放置10-20 min。
(6)4°C,12000 rpm,离心10 min。弃上清,RNA沉淀于管底。 (7)RNA沉淀中加入1 ml 75%乙醇,温和震荡离心管,悬浮沉淀。
(8)4°C,12000 g离心5 min,弃上清。再快速离心,弃上清,重复两三次。室温放置晾干1-2 min。
(9)待酒精挥发,加入50 μl Rnase-free水溶解沉淀。
(10)核酸电泳及核酸仪分析所提取的RNA的质量并测其浓度。-80°C保存。 1.3 大豆胚根总cDNA的制备
操作参考宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptRT-PCR Kit 说明书。操作如下: (1)在Microtube管中配制下列混合液。 dNTP Mixture(10 mM each)1μl Oligo dT Primer(2.5 μM)1μl Template RNA100 pg~1 μg RNase Free dH2O up to 10 μl
(2)在PCR仪上进行变性、退火反应:65℃,5 min;4℃,forever。 (3)离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。 (4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。 上述变性、退火后反应液10μl 5×PrimeScript Buffer 4μl RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5μl PrimeScript RTase(for 2 Step)0.5μl RNase Free dH2O 5μl
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Total Volume 20μl
1.4 PM18B-His和PM30-His的扩增
以大豆种子 RNA 的反转录反应液为模板,利用PM18AF或PM30AF和PM18AR或PM30AR 引物进行 PCR 反应,扩增PM18-His和PM30-His,PCR 反应体系为:
5×PrimeSTARBuffer(Mg2+ plus) dNTP Mixture(各2.5 mM) PM18AF或PM30AF(10μM) PM18AR或PM30AR(10μM) 反转录反应液
10μl 4μl 1μl 1μl 10μl
PrimeSTAR? HS DNA Polymerase(2.5 U/μl) 0.5μl 灭菌蒸馏水
23.5μl
总体积 50μl
PM18B的PCR 反应程序为:PM30的PCR 反应程序为: 94℃5min 94℃5min 94℃30sec 94℃30sec 56℃30sec30cycles 56℃30sec30cycles
72℃ 45sec 72℃ 30sec 72℃10min 72℃10min
16℃forever 16℃ forever 1.5 PCR产物的回收
PCR产物全部进行琼脂糖凝胶(含 1%琼脂糖和 0.5ug/ml 溴化乙锭)电泳,凝胶成像系统照相。从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段的操作参考宝生物工程(大连)有限公司的