内容发布更新时间 : 2024/5/2 11:43:50星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
大豆PM18B、PM30耐盐功能和定位研究
11 12
进ddH2O 进20%酒精
洗柱
封柱，防止细菌的滋生
收集所有蛋白峰，并用SDS-PAGE检测杂蛋白和目的蛋白在各蛋白峰中的存留情况。综合考虑冲洗峰（用washing buffer冲洗出来的蛋白峰）和洗脱峰（用elution buffer冲洗出来的蛋白峰）中杂蛋白和目的蛋白的含量，便可得知纯化该目的蛋白washing buffer应该含多大浓度的咪唑，即知道该目的蛋白的纯化条件。按上述摸索出来的条件纯化目的蛋白。 5．抗体anti-PM18-His、anti-PM30-His的制备与检测 5.1抗原乳化
弗氏完全佐剂微加热，用移液器吸1.0m1移入10ml灭菌小烧杯，缓慢滴入1.0m1纯化后的目的融合蛋白抗原，边滴边摇，目的融合蛋白滴入后摇至完全呈白色粘稠乳剂，并用注射器吸1小滴于冷水中，液滴仍保持完整，聚成滴状，浮于水面，即表示乳化完全，用于动物接种。 5.2 动物接种
(1) 接种前先在实验兔耳静脉采血2m1，将血清分离后保存血清于-20℃，以待作阴性对照用。
(2) 分别取上述完全乳化的目的融合蛋白与弗氏完全佐剂(CFA)混合物1m1于兔后腿肌肉及背部皮下多点注射。
(3) 第一次免疫后2周再以目的融合蛋白0.5mg加等体积弗氏不完全佐剂(IFA)充分乳化后分别于兔后腿肌肉及背部皮下多点注射加强免疫。 (4) 此后每隔10天按第二次免疫法重复加强免疫。
(5)第四次免疫后7天试血，测定血清中抗体效价。当ELISA法测定抗体效价达到1:120000左右时，心脏取血，分离血清，一80℃保存。 5.3 抗血清的收集
(1) 家兔心脏采血：家兔取仰卧位，用食指触其胸壁，探明心脏博动最明显处，取50m1注射器在该部位与胸壁成45度角刺入，待血液进入针筒后，固定位置采血。
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(2)血清分离：将所采血液置37℃凝固约2小时，然后置4℃过夜，使血块收缩，第二天将过夜的血块自试管壁分离，将血清全部吸入另50ml灭菌离心管，血块2500rpm离心20分钟，取血清部分与前面的血清混合，2500rprn离心全部分离的血清，收集上清，即完成血清的分离。兔血清立即纯化。 5.4 ELISA法分析多克隆抗体效价
(l) 抗原包被：包被缓冲液稀释纯化融合蛋白，使抗原终浓度为2μg/m1，每孔100μl常规包被96孔酶标板(留1孔作空白对照)，封口膜封板，4℃孵育过夜； (2) 取过夜包被板置37℃孵育lh； (3) PBST洗板3-5次，每次3- 5min；
(4) 封闭：每孔加100μ1PBST-5%BSA，封口，37℃孵育2h； (5) PBST洗板3-5次，每次3- 5min；
(6) 一抗孵育：依次加入PBS稀释的抗血清 (l:5000、 1:20000、 l:80000、 l:320000)100μ1，每个浓度选择2个复孔做对比，同时选择1复孔做阴性对照，37℃孵育2h；
(7)PBST洗板3-5次，每次3- 5min；
(8)二抗孵育：每孔加入100μ11:5000TBST-5%BSA稀释的HRP标记羊抗兔IgG，37℃孵育 40min；
(9)PBST洗板3-5次，每次3- 5min；
(10)加底物 TMB50μl显色 5min，每孔加入50μ12MH2SO4终止液终止反应，酶标仪450nm单波长紫外光检测。
5.5 Western Blotting检测抗体特异性
（1）将目的蛋白和阴性对照蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳； （2）切下目的条带所在位置的凝胶；
（3）根据切下凝胶的大小剪出大小一致的PVDF膜和滤纸；
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（4）将凝胶、PVDF膜及滤纸放入转膜缓冲液中湿润，从下向上按三层滤纸-PVDF膜-凝胶-三层滤纸的顺叠放在半干式转移电泳仪中，转膜40min；
（5）转膜完成后，将膜取出放入封闭液中，室温封闭1h，并不断摇动；
（6）封闭1h后将膜放入按1：250比例稀释的一抗中，孵育1h左右，并不断摇动； （7）用TTBS洗膜，每次10min，4次；
（8）按1：1000比例稀释二抗，室温孵育膜1h，并不断摇动； （9）用TTBS洗膜，每次10min，4次。再用TBS洗膜1次，10min； （10）用TMB显色试剂盒显色； （11）用水冲洗终止反应，观察结果。
第三章大豆PM18、PM30在拟南芥中的耐盐功能研究 一、实验材料 二、实验方法
1．PM18B-HA和PM30-HA的克隆 1.1引物的设计
通过NCBI（网址www.ncbi.nlm.nih.gov）进入Genbank数据库，查找大豆PM18(AF009953.1)和PM30(AF117884.1)基因碱基序列，应用GeneTool软件，分别设计上下游引物，扩增开放阅读框(ORF)的序列。PM18B的上下游引物分别命名为PM18HF和PM18HR，分别带有酶切位点BamHⅠ和SacⅠ；PM30的上下游引物分别命名为PM30HF和PM30HR，分别带有酶切位点BamHⅠ和SacⅠ。两个基因的上游引物都带有HA标签。引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。两个基因的引物的碱基序列如下：
PM18HF:5’CCGGGATCCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCGTCAAGAC
AGCAATT3’
PM18HR : 5'CACGAGCTCTCACATTTTCTCCCTAC3'
PM30HF:5’CCGGGATCCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCATCCCATAG
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GCAAAG3’
PM30HR:5’CACGAGCTCTTAGTAATTTCTGCGGTTGT3’ 1.2 PM18B-HA和PM30-HA的扩增
以测序正确的质粒T-PM18-His或T-PM30-His为模板，利用PM18HF或PM30HF和PM18HR或PM30HR为引物进行 PCR 反应，扩增PM18-HA和PM30-HA，PCR 反应体系为：
5×PrimeSTARBuffer（Mg2+ plus） dNTP Mixture（各2.5 mM） PM18HF或PM30HF（10μM） PM18HR或PM30HR（10μM）
10μl 4μl 1μl 1μl
1 μl 测序正确的质粒T-PM18B-His或T-PM30-His PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（2.5 U/μl） 0.5μl 灭菌蒸馏水
33.5μl
总体积 50μl
PM18-HA和PM30-HA的PCR 反应程序与第二章方法1.4中的PM18和PM30的PCR 反应程序相同。 1.3 PCR产物的回收
回收的方法与第二章方法1.5相同。 1.4 PCR产物5’端的延伸 方法与第二章方法1.6相同。 1.5延伸产物的回收
方法与第二章方法1.7相同。
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1.6基因片段与PMD18B-T-simple vector 的连接 方法与第二章方法1.8相同。
1.7连接产物对大肠杆菌超级感受态的转化 方法与第二章方法1.9相同。
1.8 重组菌TOP10-T-PM18B-HA和TOP10-T-PM30-HA的鉴定
方法与第二章方法1.10相同。
2．植物表达载体pBI121-PM18B-HA、pBI121-PM30-HA的构建 2.1 重组质粒T-PM18B-HA和T-PM30-HA的提取 方法与第二章方法2.1相同。
2.2 质粒T-PM18B-HA、T-PM30-HA和pBI-121的双酶切
酶切反应在 37℃水浴中进行，反应 3-5h 后进行琼脂糖凝胶电泳，Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的片段，方法如第二章1.5
质粒T-PM18-HA、T-PM30-HA和pBI-121的双酶切体系如下：
T-PM18-HA、T-PM30-HA和pBI-121（80ng/μl） BamHⅠ SacⅠ 10×K Buffer
30μl 2.5μl 2.5μl 5μl
无菌ddH2O 10μl
总体积 50μl
2.3 目的片段与植物表达载体的连接
双酶切后经过切胶回收的目的片段和载体相连接，连接体系如下：