内容发布更新时间 : 2024/7/1 17:19:52星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，

最好戴上帽子、手套；

2、进去后用酒精棉球擦洗手；

3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌； 4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可； 5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；

6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；

7、出门后需要用钥匙锁上； 8、整个无菌间两周清洁一次；

免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常用的是Balbc/c

小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；

首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；

间隔两周左右时间（14天）

二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在； 间隔两周左右时间（14天）

三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在； 间隔7-10天左右时间 尾部采血测定抗体效价：

方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量0.1ml。 方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。

实际操作显示，采血使用剪尾方法较好，一人固定小鼠，另一人直接在尾端剪掉1-2mm，从尾根部向尾尖部按摩，在尾端可见一滴血，吸取2.0微升加在2ml的PBS溶液中，直接稀释1000倍，混匀，再倍比稀释测定效价； 当日或次日，对全血用生理盐水进行倍比稀释，测定抗体效价，效价未达到标准，则继续进行常规免疫，效价达到标准，则选择效价最高的一只小鼠作为脾细胞源鼠，并在细胞融合三天前尾静脉注射加强免疫。

随后，取冻存好的瘤细胞进行复苏、培养、扩瓶，直到单只小鼠细胞融合需要稳定良好生长瘤细胞培养液约为120ml（大约一周可以完成），之后可进行细胞融

合实验；

在细胞融合三天前（72-96小时），直接尾部静脉注射50微克抗原加强免疫；先用烧杯固定小鼠露出尾巴，用温水（水温约50度左右）泡大约2分钟，这样能使血管充分舒张。用干棉球擦干；用1毫升注射器选择两侧较浅的静脉穿刺注射抗原，位置选择尾部中下2/3~1/2处比较好,从下向上扎，万一一次扎不进，还可以继续使用此血管。具体操作是左手食指和中指上下夹注你所选择血管的靠近身体的一边,无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾(建立一个穿刺的平面的作用),拇指压住所选血管的尾尖端,上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜.(否则容易人为建立穿刺的角度,而使右手持穿刺针穿刺过深,导致穿刺失败.)右手持穿刺针,稍微挑起皮肤一点,就可以平着进针,看到回血表明成功,还可以回抽,见到回血后表明穿刺已进入血管,可以给药.穿刺结束后,用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血.良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用,这对于需要天天穿刺给药是非常有用的（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血）。如果尾部静脉注射未能成功，则进行腹腔注射。

瘤细胞饲养

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶4或6进行稀释传代，每3～5天可传代一次。上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

1、显微镜观察细胞形态，呈较亮表明细胞生长良好，反之颜色较深，可见一些

小黑点，可能细胞已大部分死亡；

2、状态良好，装入二氧化碳培养箱静置培养37℃，5%二氧化碳浓度，T25细胞

培养瓶培养液可加15ml含10-20%的灭火小牛血清DMEM培养基进行培养（酒精擦洗，有菌及时擦洗，常规一月一次，常开）

3、每日显微镜观察细胞状态，贴壁较多（细胞挤在一起几乎无空白区域）或培

养液颜色变黄换液（倒出上清液，加新鲜培养液大体盖住底部，细胞过多在加新鲜培养基前吹打）一般3-5可重新长满 4、换液2-3次

5、生长稳定后，扩瓶，先1:4（细胞液：新鲜培养基）扩瓶，之后可适当增大比

例，扩增到自己需要的培养液；

6、冻存，取生长良好的细胞液，吹打混匀，转到50ml离心管中离心，1000rpm

10min弃上清， 底部为白色沉淀，加新鲜冻存液（DMEM 60 FBS30 DMSO 10 双抗1），分装在2ml冻存管中加1ml （约每5ml细胞液原液对应1管—1ml），在管子上面注明日期、名称，先在4度中静置数小时，再在液氮液面上悬30—60min，之后放入液氮中冻存； 7、复苏，拉线取出冻存管，用漂悬浮在盛有37度水的烧杯，烧杯置于水浴锅中，

待融化后转移到含有新鲜培养基的细胞培养瓶中混匀，进行培养，在次日一定要更新培养基，去除DMSO，以有利于后续的培养； 8、 细胞融合时，将3瓶生长良好的细胞液转移在50ml离心管中，1000rpm 10min，

弃上清；加30ml DMEM 离心洗涤一次，加10ml 重悬混匀，血细胞计数板计数备用；

在实际培养中，大概三天后细胞基本可以长满，四天开始出现细胞死亡情况，五天后有半数细胞死亡，六天后大部分死亡。

HAT培养液浓度选择

商品化HAT多为50×，先用不完全培养基溶解后（10ml一管），按比例加到完全培养基中制成HAT培养基；HAT一般含量偏高，做梯度培养瘤细胞实验选择合适的HAT培养液浓度； 用24孔板和SP2/0进行

在各孔中加等体积的培养液，培养细胞，待长成单层细胞后依照下表添加不同量的HAT培养观察死亡情况； 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 选择第一天死亡半数细胞；第二天死亡大部分细胞；第三天全部死亡的浓度； 在实际试验中，不同梯度的HAT均可导致瘤细胞的快速死亡，具体试验可选用2%，亦可选用1%；

饲养细胞制备

在细胞融合前，三天内购买Balb/c或KM小鼠2-3只（个体易较大），在细胞融合当天制备饲养细胞；

器材与试剂：解剖工具、5ml玻璃注射器、96孔板、50ml离心管、血细胞计数板、HAT培养液、75%的酒精、250ml烧杯； 操作方法：

1、将小鼠摘眼球或拉颈脱臼处死，浸泡在75%酒精中5min，随即放入超净台内，小鼠腹部朝上；

2、酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血钳将腹部皮肤拉开，完全露出腹膜；

3、镊子小心提起小鼠腹部皮肤，注射5ml DMEM溶液，轻轻按摩腹部1-2分钟； 4、用注射器吸出腹腔内液体，转于50ml离心管中，1000rpm, 10min，弃上清液；

5

5、用5ml HAT培养液重悬沉淀，细胞计数，补加液体至细胞浓度为2*10个/ml； 6、加在96孔板中，每孔100微升，进行培养；(96孔板约为6块) 一般18-24h后细胞生长良好；在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞。初始饲养细胞均为小圆形，之后逐渐曾梭形，即巨噬细胞，可吞噬死亡细胞残片，梭形细胞较多时，周围会出现相对空白的区域，反之，巨噬细胞较少，在换液时应适当补充饲养细胞；

脾细胞悬液制备

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。